An druga frith-theilminteach N,N-dé-eitile-m-tóluaimíd (DEETTuairiscíodh go gcuireann ) cosc ar AChE (aicéitilcholinesterase) agus go bhfuil airíonna carcanaigineacha féideartha aige mar gheall ar ró-vascularú. Sa pháipéar seo, taispeánaimid go spreagann DEET cealla inchríneacha go sonrach a chuireann angiogenesis chun cinn, rud a mhéadaíonn fás meall. Gníomhaíonn DEET próisis cheallacha as a dtiocfaidh angiogenesis, lena n-áirítear iomadú, imirce agus greamaitheacht. Tá baint aige seo le méadú ar tháirgeadh NO agus ar léiriú VEGF i gcealla inchríneacha. Chuir tostú M3 nó úsáid coscairí cógaseolaíocha M3 deireadh leis na héifeachtaí seo go léir, rud a thugann le fios go bhfuil angiogenesis spreagtha ag DEET íogair do M3. Léiríonn turgnaimh a bhaineann le comharthaíocht chailciam i gcealla inchríneacha agus HEK a ró-léiríonn gabhdóirí M3, chomh maith le staidéir cheangailteach agus dugaireachta, go bhfeidhmíonn DEET mar mhodúlóir allosteric de ghabhdóirí M3. Ina theannta sin, cuireann DEET cosc ar AChE, rud a mhéadaíonn bith-infhaighteacht aicéitilcholine agus a cheangal le gabhdóirí M3, agus a fheabhsaíonn éifeachtaí pro-angiogenic trí rialáil allosteric.
Leithlisíodh ECanna príomhúla ó aorta lucha Eilvéiseacha. Oiriúnaíodh an modh eastósctha ó phrótacal Kobayashi 26. Saothraíodh ECanna lucha i meán EBM-2 a raibh 5% FBS teas-neamhghníomhachtaithe curtha leis go dtí an ceathrú pasáiste.
Rinneadh anailís ar éifeacht dhá thiúchan DEET ar iomadú HUVEC, U87MG, nó BF16F10 ag baint úsáide as an Trealamh Measúnachta Ilphlandúcháin Cealla CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Go hachomair, cuireadh 5.103 cealla in aghaidh an tobair i pláta 96-tholl, ligeadh dóibh ceangal thar oíche, agus ansin rinneadh cóireáil orthu le DEET ar feadh 24 uair an chloig. Tar éis an meán fáis a bhaint, cuir tuaslagán ceangailteach ruaime le gach tobar den mhicreaphláta agus gor na cealla ag 37 °C ar feadh 30 nóiméad. Cinneadh leibhéil fluaraiseachta ag baint úsáide as léitheoir micreaphláta ilmhód Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, an Ghearmáin) a raibh scagairí spreagtha 485 nm agus scagairí astaíochta 530 nm feistithe air.
Cuireadh síolta HUVEC i plátaí 96-tholl ag dlús 104 cealla in aghaidh an tobair. Rinneadh na cealla a chóireáil le DEET ar feadh 24 uair an chloig. Rinneadh measúnú ar inmharthanacht na gceall ag baint úsáide as measúnacht MTT dathmhéadrach (Sigma-Aldrich, M5655). Fuarthas luachanna dlúis optúla ar léitheoir micreaphláta ilmhód (Mithras LB940) ag tonnfhad 570 nm.
Rinneadh staidéar ar éifeachtaí DEET ag baint úsáide as measúnuithe angiogenesis in vitro. Mhéadaigh cóireáil le 10-8 M nó 10-5 M DEET foirmiú fad ribeadáin i HUVECanna (Fíor 1a, b, barraí bána). I gcomparáid leis an ngrúpa rialaithe, léirigh cóireáil le tiúchain DEET idir 10-14 agus 10-5 M gur shroich fad an ribeadáin ardchlár ag 10-8 M DEET (Fíor Fhorlíontach S2). Ní bhfuarthas aon difríocht shuntasach in éifeacht pró-angiogenach in vitro HUVECanna a ndearnadh cóireáil orthu le DEET sa raon tiúchana 10-8 M agus 10-5 M.
Chun éifeacht DEET ar neovascularú a chinneadh, rinneamar staidéir neovascularú in vivo. Tar éis 14 lá, léirigh lucha ar instealladh cealla endothelial iontu a raibh 10-8 M nó 10-5 M DEET réamhchultúrtha iontu méadú suntasach ar ábhar haemaglóibin (Fíor 1c, barraí bána).
Ina theannta sin, rinneadh staidéar ar neovascularú spreagtha ag DEET i lucha a raibh xenograft U87MG orthu a instealladh go laethúil (ip) le DEET ag dáileog ar a bhfuil a fhios go spreagann sé tiúchan plasma de 10-5 M, rud atá gnáth i ndaoine nochtaithe. i 23. Breathnaíodh siadaí inbhraite (i.e. siadaí >100 mm3) 14 lá tar éis instealladh cealla U87MG i lucha. Ag lá 28, bhí fás siadaí feabhsaithe go suntasach i lucha ar tugadh DEET dóibh i gcomparáid le lucha rialaithe (Fíor 1d, cearnóga). Ina theannta sin, léirigh staining CD31 siadaí gur mhéadaigh DEET achar ribeach go suntasach ach ní dlús micrishoithíoch. (Fíor 1e–g).
Chun ról na ngabhdóirí múscarineacha i iomadú spreagtha ag DETA a chinneadh, úsáideadh 10-8 M nó 10-5 M DETA i láthair pFHHSiD (10-7 M, antagonist gabhdóra M3 roghnach). Cóireáil HUVEC. Chuir pFHHSiD bac iomlán ar airíonna iomadúla DETA ag gach tiúchan (Tábla 1).
Faoi na coinníollacha seo, rinneamar scrúdú freisin ar cé acu an méadódh DEET fad na ribeadán i gcealla HUVEC. Ar an gcaoi chéanna, chuir pFHHSiD cosc suntasach ar fhad na ribeadán a spreag DEET (Fíor 1a, b, barraí liatha). Ina theannta sin, rinneadh turgnaimh chomhchosúla le siRNA M3. Cé nach raibh an siRNA rialaithe éifeachtach maidir le foirmiú ribeadán a chur chun cinn, chuir tostú an ghabhdóra mhuscairinigh M3 deireadh le cumas DEET fad na ribeadán a mhéadú (Fíor 1a, b, barraí dubha).
Ina theannta sin, chuir pFHHSiD bac iomlán ar shoithíochtú in vitro agus ar neo-shoithíocht in vivo spreagtha ag DEET 10-8 M nó 10-5 M (Fíor 1c, d, ciorcail). Léiríonn na torthaí seo go gcuireann DEET angiogenesis chun cinn trí chonair atá íogair d’antagonists gabhdóra M3 roghnacha nó M3 siRNA.
Is é AChE sprioc mhóilíneach DEET. Is féidir le drugaí ar nós donepezil, a fheidhmíonn mar choscóirí AChE, angiogenesis EC a spreagadh in vitro agus i samhlacha ischemia géaga deiridh lucha14. Rinneamar tástáil ar éifeacht dhá thiúchan DEET ar ghníomhaíocht einsím AChE i HUVEC. Laghdaigh tiúchain ísle (10-8 M) agus arda (10-5 M) de DEET gníomhaíocht AChE endothelial i gcomparáid le coinníollacha rialaithe (Fíor 2).
Laghdaigh an dá thiúchan DEET (10-8 M agus 10-5 M) gníomhaíocht aicéitilcholinesterase ar HUVEC. Baineadh úsáid as BW284c51 (10-5 M) mar rialú do choscóirí aicéitilcholinesterase. Léirítear na torthaí mar chéatadán de ghníomhaíocht AChE ar HUVEC a ndearnadh cóireáil orthu leis an dá thiúchan DEET i gcomparáid le cealla a ndearnadh cóireáil orthu le feithicil. Léirítear luachanna mar mheán ± SEM de shé thurgnamh neamhspleácha. *p < 0.05 i gcomparáid leis an rialú (tástáil ilchomparáide Kruskal-Wallis agus Dunn).
Tá ocsaíd nítreach (NO) páirteach sa phróiseas angiogenic 33, dá bhrí sin, rinneadh staidéar ar tháirgeadh NO i HUVECanna spreagtha ag DEET. Méadaíodh táirgeadh NO endothelial cóireáilte le DEET i gcomparáid le cealla rialaithe, ach níor shroich sé suntasacht ach ag dáileog de 10-8 M (Fíor 3c). Chun na hathruithe móilíneacha a rialaíonn táirgeadh NO spreagtha ag DEET a chinneadh, rinneadh anailís ar léiriú agus gníomhachtú eNOS trí Western blotting. Cé nár athraigh cóireáil DEET léiriú eNOS, mhéadaigh sé fosfaraileadh eNOS go suntasach ag a shuíomh gníomhachtaithe (Ser-1177) agus laghdaigh sé a shuíomh coisctheach (Thr-495) i gcomparáid le cealla neamhchóireáilte i bhfosfaraileadh eNOS (Fíor 3d). Ina theannta sin, ríomhadh an cóimheas eNOS fosfarailithe ag an suíomh gníomhachtaithe agus an suíomh coisctheach tar éis méid an eNOS fosfarailithe a normalú i gcomparáid le méid iomlán an einsím. Méadaíodh an cóimheas seo go suntasach i HUVECanna cóireáilte le gach tiúchan de DEET i gcomparáid le cealla neamhchóireáilte (Fíor 3d).
Ar deireadh, rinneadh anailís ar léiriú VEGF, ceann de na príomhfhachtóirí pró-angiogenacha, trí Western blotting. Mhéadaigh DEET léiriú VEGF go suntasach, ach chuir pFHHSiD bac iomlán ar an léiriú seo.
Ós rud é go bhfuil éifeachtaí DEET íogair maidir le bac cógaseolaíoch agus laghdú gabhdóirí M3 araon, rinneamar tástáil ar an hipitéis go bhféadfadh DEET comharthaíocht chailciam a fheabhsú. Ar ionadh, theip ar DEET cailciam cíteaplasmach a mhéadú i HUVEC (níor taispeánadh sonraí) agus HEK/M3 (Fíor 4a, b) don dá thiúchan a úsáideadh.
Am poist: 30 Nollaig 2024