Tá fás meiristéime apical na ngéag (SAM) ríthábhachtach d'ailtireacht an ghais. Hormóin plandaígibberellinsTá róil lárnacha ag (GAanna) i gcomhordú fáis plandaí, ach níl a ról san SAM soiléir fós. Anseo, d'fhorbraíomar bithbhraiteoir cóimheasúil de chomharthaíocht GA tríd an bpróitéin DELLA a innealtóireacht chun a fheidhm rialála riachtanach i bhfreagairt thrascríobh GA a chosc agus a dhíghrádú a chaomhnú nuair a aithnítear GA. Léirímid go dtaifeadann an bithbhraiteoir seo atá bunaithe ar dhíghrádú athruithe i leibhéil GA agus i mbraiteadh ceallach le linn forbartha go cruinn. D'úsáideamar an bithbhraiteoir seo chun gníomhaíocht chomharthaíochta GA san SAM a mhapáil. Léirímid go bhfuil comharthaí arda GA i láthair den chuid is mó i gcealla atá suite idir primordia orgán, ar réamhtheachtaithe iad do chealla internod. Ag baint úsáide as cur chuige gnóthachain agus caillteanais feidhme, léirímid tuilleadh go rialaíonn GA treoshuíomh phlána deighilte na gceall, ag bunú eagrú ceallach canónach na n-internóid, agus ar an gcaoi sin sonraíocht internod san SAM a chur chun cinn.
Tá nideoige gaschealla sa mheiristeam barr an ghéibheann (SAM), atá suite ag barr an ghéibheann, a ghineann orgáin chliathánacha agus nóid ghéibheann ar bhealach modúlach agus athchleachtach ar feadh shaolré an phlanda. Cuimsíonn gach ceann de na haonaid athchleachtacha seo, nó nóid plandaí, internóidí agus orgáin chliathánacha ag na nóid, agus meiristéimí aicsilleacha in aicsil na nduilleog1. Athraíonn fás agus eagrú nóid plandaí le linn na forbartha. In Arabidopsis, cuirtear cosc ar fhás internodal le linn na céime fásúla, agus fanann meiristéimí aicsilleacha díomhaoin in aicsil na nduilleog rosette. Le linn an aistrithe go dtí an chéim bláthanna, bíonn an SAM ina mheiristeam inflorescence, ag giniúint internóidí fadaithe agus bachlóga aicsilleacha, craobhóga in aicsil na nduilleog cauline, agus níos déanaí, bláthanna gan duilleoga2. Cé go bhfuil dul chun cinn suntasach déanta againn maidir le tuiscint a fháil ar na meicníochtaí a rialaíonn tionscnamh duilleoga, bláthanna agus brainsí, is beag atá ar eolas againn faoi conas a thagann internóidí chun cinn.
Cuideoidh tuiscint ar dháileadh spásúil ama GAanna le feidhmeanna na hormóin seo a thuiscint níos fearr i bhfíocháin éagsúla agus ag céimeanna forbartha éagsúla. Soláthraíonn léirshamhlú ar dhíghrádú an chomhleá RGA-GFP a chuirtear in iúl faoi ghníomhaíocht a phromótóra féin faisnéis thábhachtach maidir le rialáil leibhéil iomlána GA i bhfréamhacha15,16. Mar sin féin, athraíonn léiriú RGA trasna fíochán17 agus rialaíonn GA18 é. Dá bhrí sin, d'fhéadfadh léiriú difreálach an phromótóra RGA an patrún fluaraiseachta a breathnaíodh le RGA-GFP a bheith mar thoradh air agus mar sin níl an modh seo cainníochtúil. Le déanaí, nocht GA lipéadaithe le fluaraiséin (Fl) bithghníomhach19,20 carnadh GA in endocortex na fréimhe agus rialáil a leibhéil cheallacha trí iompar GA. Le déanaí, léirigh an braiteoir GA FRET nlsGPS1 go bhfuil baint ag leibhéil GA le fadú cille i bhfréamhacha, i bhfiliméid, agus i hipeacotailí dorcha21. Mar sin féin, mar atá feicthe againn, ní hé tiúchan GA an t-aon pharaiméadar a rialaíonn gníomhaíocht chomharthaíochta GA, toisc go mbraitheann sé ar phróisis chasta braite. Anseo, ag cur lenár dtuiscint ar chonairí comharthaíochta DELLA agus GA, tuairiscímid forbairt agus tréithriú bithbhraiteora cóimheasméadrach bunaithe ar dhíghrádú le haghaidh comharthaíocht GA. Chun an bithbhraiteoir cainníochtúil seo a fhorbairt, d'úsáideamar RGA só-íogair GA a comhleádh le próitéin fhluaraiseach agus a léiríodh go forleathan i bhfíocháin, chomh maith le próitéin fhluaraiseach neamh-íogair GA. Taispeánaimid nach gcuireann na comhleá próitéine RGA só-íogair isteach ar chomharthaíocht GA endogenous nuair a léirítear go forleathan iad, agus gur féidir leis an mbithbhraiteoir seo gníomhaíocht chomharthaíochta a chainníochtú a eascraíonn as ionchur GA agus próiseáil comhartha GA ag an ngléas braite le réiteach ard spásama agus ama. D'úsáideamar an bithbhraiteoir seo chun dáileadh spásama agus ama ghníomhaíocht chomharthaíochta GA a mhapáil agus chun cainníochtú a dhéanamh ar an gcaoi a rialaíonn GA iompar ceallach san eipideirm SAM. Léirímid go rialaíonn GA treoshuíomh an eitleáin deighilte de chealla SAM atá suite idir primordia orgán, rud a shainmhíníonn eagrú ceallach canónach an internode.
Ar deireadh, d'fhiafraíomar an bhféadfadh qmRGA athruithe i leibhéil GA intíre a thuairisciú trí úsáid a bhaint as hipeacotailí atá ag fás. Thaispeánamar roimhe seo go spreagann níotráit fás trí shintéis GA a mhéadú agus, dá réir sin, díghrádú DELLA34. Dá réir sin, thugamar faoi deara go raibh fad na hipeacotaile i síológa pUBQ10::qmRGA a fhástar faoi sholáthar flúirseach níotráite (10 mM NO3−) i bhfad níos faide ná fad na hipeacotaile i síológa a fhástar faoi choinníollacha easnamhach níotráite (Fíor Forlíontach 6a). Ag teacht leis an bhfreagairt fáis, bhí comharthaí GA níos airde i hipeacotailí síológa a fhástar faoi choinníollacha 10 mM NO3− ná i síológa a fhástar in éagmais níotráite (Fíor Forlíontach 6b, c). Dá bhrí sin, cuireann qmRGA ar chumas monatóireacht a dhéanamh ar athruithe i gcomharthaíocht GA a spreagtar ag athruithe intíre i dtiúchan GA.
Chun tuiscint a fháil ar cibé an mbraitheann an ghníomhaíocht chomharthaíochta GA a bhraitear le qmRGA ar thiúchan GA agus ar bhraistint GA, mar a bhíothas ag súil leis bunaithe ar dhearadh an braiteora, rinneamar anailís ar léiriú na dtrí ghabhdóir GID1 i bhfíocháin fhásúla agus atáirgthe. I síológa, léirigh an líne tuairisceora GID1-GUS go raibh GID1a agus c léirithe go hard i gcótailéadóin (Fíor 3a–c). Ina theannta sin, léiríodh na trí ghabhdóir i nduilleoga, i bpríomhfhréamhacha cliathánacha, i mbarr fréimhe (seachas caipín fréimhe GID1b), agus sa chóras soithíoch (Fíor 3a–c). Sa SAM inflorescence, níor bhraith muid comharthaí GUS ach do GID1b agus 1c (Fíor Fhorlíontach 7a–c). Dheimhnigh hibridiú in situ na patrúin léirithe seo agus léirigh sé tuilleadh go raibh GID1c léirithe go haonfhoirmeach ag leibhéil ísle sa SAM, ach gur léirigh GID1b léiriú níos airde ag imeall an SAM (Fíor Fhorlíontach 7d–l). Léirigh an comhleá aistriúcháin pGID1b::2xmTQ2-GID1b raon grádaithe de léiriú GID1b freisin, ó léiriú íseal nó gan aon léiriú i lár an SAM go léiriú ard ag teorainneacha na n-orgán (Fíor Fhorlíontach 7m). Dá bhrí sin, níl gabhdóirí GID1 dáilte go haonfhoirmeach trasna agus laistigh de fhíocháin. I dturgnaimh ina dhiaidh sin, thugamar faoi deara freisin gur mhéadaigh ró-léiriú GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) íogaireacht qmRGA i hipeacotailí d'fheidhmchlár seachtrach GA (Fíor 3d, e). I gcodarsnacht leis sin, ní raibh an fhluaraiseacht a tomhaiseadh le qd17mRGA san hipeacotail íogair do chóireáil GA3 (Fíor 3f, g). I gcás an dá anailís, rinneadh síológa a chóireáil le tiúchain arda GA (100 μM GA3) chun iompar tapa an braiteora a mheas, áit ar feabhsaíodh nó ar cailleadh an cumas ceangal leis an ngabhdóir GID1. Le chéile, dearbhaíonn na torthaí seo go bhfreastalaíonn an bithbhraiteoir qmRGA ar fheidhm chomhcheangailte mar braiteoir GA agus GA, agus tugann siad le fios gur féidir le difreáil léirithe an ghabhdóra GID1 astaíocht an braiteora a mhodhnú go suntasach.
Go dtí seo, níl dáileadh comharthaí GA sa SAM soiléir fós. Dá bhrí sin, d'úsáideamar plandaí a léiríonn qmRGA agus an tuairisceoir gascheall pCLV3::mCherry-NLS35 chun léarscáileanna cainníochtúla ardtaifigh de ghníomhaíocht chomharthaíochta GA a ríomh, ag díriú ar an tsraith L1 (an eipideirm; Fíor 4a, b, féach Modhanna agus Modhanna Forlíontacha), ós rud é go bhfuil ról lárnach ag L1 i rialú fás SAM36. Anseo, sholáthair léiriú pCLV3::mCherry-NLS pointe tagartha geoiméadrach seasta chun dáileadh spásama agus ama ghníomhaíocht chomharthaíochta GA37 a anailísiú. Cé go meastar go bhfuil GA riachtanach d'fhorbairt orgán cliathánach4, thugamar faoi deara go raibh comharthaí GA íseal sa phríomhordiam bláthanna (P) ag tosú ón gcéim P3 (Fíor 4a, b), ach bhí gníomhaíocht mheasartha ag príomhordiamaí óga P1 agus P2 cosúil leis an ngníomhaíocht sa réigiún lárnach (Fíor 4a, b). Braitheadh gníomhaíocht chomharthaíochta GA níos airde ag teorainneacha primordium an orgáin, ag tosú ag P1/P2 (ar thaobhanna na teorann) agus ag buaicphointe ag P4, chomh maith le i ngach cealla den réigiún imeallach atá suite idir na primordia (Fíor 4a, b agus Fíor Fhorlíontach 8a, b). Breathnaíodh an ghníomhaíocht chomharthaíochta GA níos airde seo ní hamháin san eipideirm ach sna sraitheanna L2 agus L3 uachtaracha freisin (Fíor Fhorlíontach 8b). D'fhan patrún na gcomharthaí GA a braitheadh sa SAM ag baint úsáide as qmRGA gan athrú le himeacht ama (Fíor Fhorlíontach 8c–f, k). Cé gur laghdaíodh an tógáil qd17mRGA go córasach i SAM na bplandaí T3 ó chúig líne neamhspleácha a ndearnamar tréithriú orthu go mion, bhíomar in ann na patrúin fluaraiseachta a fuarthas leis an tógáil pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP a anailísiú (Fíor Fhorlíontach 8g–j, l). Sa líne rialaithe seo, níor braitheadh ach athruithe beaga sa chóimheas fluaraiseachta sa SAM, ach i lár an SAM bhreathnaíomar laghdú soiléir agus gan choinne i VENUS a bhaineann le TagBFP. Deimhníonn sé seo go léiríonn an patrún comharthaíochta a breathnaíodh le qmRGA díghrádú mRGA-VENUS atá ag brath ar GA, ach léiríonn sé freisin go bhféadfadh qmRGA rómheastachán a dhéanamh ar ghníomhaíocht chomharthaíochta GA i lár an mheristéime. Mar achoimre, nochtann ár dtorthaí patrún comharthaíochta GA a léiríonn dáileadh na bpríomhtheachtaí go príomha. Tá an dáileadh seo ar an réigiún idir-phríomhtheachtaí (IPR) mar gheall ar bhunú de réir a chéile gníomhaíochta comharthaíochta GA ard idir an primordium atá ag forbairt agus an réigiún lárnach, agus ag an am céanna laghdaíonn gníomhaíocht chomharthaíochta GA sa phríomhtheachtaí (Fíor 4c, d).
Tugann dáileadh na ngabhdóirí GID1b agus GID1c (féach thuas) le fios go gcabhraíonn léiriú difreálach gabhdóirí GA le patrún ghníomhaíocht chomharthaíochta GA sa SAM a mhúnlú. Bhíomar ag smaoineamh an bhféadfadh carnadh difreálach GA a bheith i gceist. Chun an fhéidearthacht seo a imscrúdú, d'úsáideamar an braiteoir FRET GA nlsGPS121. Braitheadh minicíocht ghníomhachtaithe méadaithe i SAM nlsGPS1 a ndearnadh cóireáil air le 10 μM GA4+7 ar feadh 100 nóiméad (Fíor Fhorlíontach 9a–e), rud a léiríonn go bhfreagraíonn nlsGPS1 d'athruithe i dtiúchan GA sa SAM, mar a dhéanann sé i bhfréamhacha21. Léirigh dáileadh spásúil minicíocht ghníomhachtaithe nlsGPS1 leibhéil GA réasúnta ísle i sraitheanna seachtracha an SAM, ach léirigh sé go raibh siad ardaithe i lár agus ag teorainneacha an SAM (Fíor 4e agus Fíor Fhorlíontach 9a,c). Tugann sé seo le fios go bhfuil GA dáilte sa SAM freisin le patrún spásúil inchomparáide leis an gceann a nochtann qmRGA. Mar chur chuige comhlántach, rinneamar cóireáil ar an SAM le GA fluaraiseach (GA3-, GA4-, GA7-Fl) nó Fl leis féin mar rialú diúltach. Scaipeadh an comhartha Fl ar fud an SAM, lena n-áirítear an réigiún lárnach agus an primordium, cé go raibh déine níos ísle aige (Fíor 4j agus Fíor Fhorlíontach 10d). I gcodarsnacht leis sin, charnaigh na trí GA-Fl go sonrach laistigh de theorainneacha an primordium agus go céimeanna éagsúla sa chuid eile den IPR, agus GA7-Fl ag carnadh sa réimse is mó san IPR (Fíor 4k agus Fíor Fhorlíontach 10a,b). Léirigh cainníochtú déine fluaraiseachta go raibh an cóimheas déine IPR le neamh-IPR níos airde i SAM cóireáilte le GA-Fl i gcomparáid le SAM cóireáilte le Fl (Fíor 4l agus Fíor Fhorlíontach 10c). Le chéile, tugann na torthaí seo le fios go bhfuil GA i láthair ag tiúchain níos airde i gcealla IPR atá suite is gaire do theorainn an orgáin. Tugann sé seo le fios gur toradh ar léiriú difreálach gabhdóirí GA agus ar charnadh difreálach GA i gcealla IPR gar do theorainneacha orgán atá patrún ghníomhaíochta comharthaíochta GA SAM. Dá bhrí sin, nocht ár n-anailís patrún spásama agus ama gan choinne de chomharthaíocht GA, le gníomhaíocht níos ísle i lár agus i bpríomh-lár SAM agus gníomhaíocht níos airde san IPR sa réigiún imeallach.
Chun ról na gníomhaíochta comharthaíochta difreálaí GA sa SAM a thuiscint, rinneamar anailís ar an gcomhghaol idir gníomhaíocht comharthaíochta GA, leathnú cille, agus deighilt cille ag baint úsáide as íomháú fíor-ama ama den SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. I bhfianaise ról GA i rialáil fáis, bhíothas ag súil le comhghaol dearfach le paraiméadair leathnú cille. Dá bhrí sin, rinneamar comparáid ar dtús idir léarscáileanna gníomhaíochta comharthaíochta GA agus léarscáileanna de ráta fáis dhromchla cille (mar ionadaí do neart leathnú cille do chill ar leith agus do chealla iníne ag an deighilt) agus le léarscáileanna d'ainisotrópacht fáis, a thomhaiseann treo leathnú cille (a úsáidtear anseo freisin do chill ar leith agus do chealla iníne ag an deighilt; Fíor 5a,b, féach Modhanna agus Modhanna Forlíontacha). Tá ár léarscáileanna de ráta fáis dhromchla cille SAM comhsheasmhach le breathnuithe roimhe seo38,39, le rátaí fáis íosta ag an teorainn agus rátaí fáis uasta i mbláthanna atá ag forbairt (Fíor 5a). Léirigh anailís chomhpháirteanna príomhúla (PCA) go raibh gníomhaíocht comharthaíochta GA comhghaolmhar go diúltach le déine fáis dhromchla cille (Fíor 5c). Léirigh muid freisin go raibh na príomh-aiseanna athraitheachta, lena n-áirítear ionchur comharthaíochta GA agus déine fáis, ortagónach leis an treo a chinntear trí ard-léiriú CLV3, rud a dheimhníonn eisiamh cealla ó lár SAM sna hanailísí atá fágtha. Dheimhnigh anailís chomhghaolmhaireachta Spearman torthaí an PCA (Fíor 5d), rud a léiríonn nár eascair leathnú cille níos airde as comharthaí GA níos airde san IPR. Mar sin féin, léirigh anailís chomhghaolmhaireachta comhghaol dearfach beag idir gníomhaíocht chomharthaíochta GA agus ainiséatrópacht fáis (Fíor 5c, d), rud a thugann le fios go mbíonn tionchar ag comharthaíocht GA níos airde san IPR ar threo fáis cille agus b'fhéidir ar shuíomh phlána deighilte na cille.
a, b Léarscáileanna teasa de mheánfhás dromchla (a) agus ainisatrópacht fáis (b) i SAM arna meánú thar sheacht bplanda neamhspleácha (a úsáidtear mar ionadaithe do neart agus treo leathnú cille, faoi seach). c Áiríodh na hathróga seo a leanas san anailís PCA: comhartha GA, déine fáis dromchla, ainisatrópacht fáis dromchla, agus léiriú CLV3. Bhí comhghaol diúltach den chuid is mó ag comhpháirt 1 PCA le déine fáis dromchla agus comhghaol dearfach le comhartha GA. Bhí comhpháirt 2 PCA comhghaol dearfach den chuid is mó le ainisatrópacht fáis dromchla agus comhghaol diúltach le léiriú CLV3. Léiríonn céatadáin an éagsúlacht a mhínítear le gach comhpháirt. d Anailís chomhghaolmhaireachta Spearman idir comhartha GA, déine fáis dromchla, agus ainisatrópacht fáis dromchla ag scála fíocháin gan CZ san áireamh. Is é an uimhir ar dheis luach rho Spearman idir dhá athróg. Léiríonn réaltaí cásanna ina bhfuil an comhghaol/comhghaol diúltach an-suntasach. e Amharcléiriú 3T de chealla Col-0 SAM L1 trí mhicreascópacht chomhfócasach. Tá ballaí cille nua a foirmíodh sa SAM (ach ní an primordium) ag 10 uair an chloig daite de réir a luachanna uillinne. Taispeántar an barra datha sa chúinne íochtarach ar dheis. Taispeánann an t-inset an íomhá 3T chomhfhreagrach ag 0 h. Rinneadh an turgnamh arís faoi dhó le torthaí comhchosúla. f Taispeánann plotaí bosca rátaí roinnte cille i SAM IPR agus neamh-IPR Col-0 (n = 10 planda neamhspleácha). Taispeánann an líne lárnach an meán, agus léiríonn teorainneacha na mboscaí an 25ú agus an 75ú peircintíl. Léiríonn na fuaidreacha na luachanna íosta agus uasta a cinneadh le bogearraí R. Fuarthas luachanna P le tástáil t dhá-eireaballach Welch. g, h Léaráid sceitseach a thaispeánann (g) conas uillinn an bhalla cille nua (maigeanta) a thomhas i leith an treo gathach ó lár an SAM (líne poncaithe bán) (ní chuirtear san áireamh ach luachanna uillinne géara, ie, 0–90°), agus (h) na treoracha imlíne/cliathánacha agus gathacha laistigh den mheiristeam. i Histogramaí minicíochta de threoshuíomh eitleáin roinnte cille trasna an SAM (gorm dorcha), IPR (gorm meánach), agus neamh-IPR (gorm éadrom), faoi seach. Fuarthas luachanna P trí thástáil Kolmogorov-Smirnov déthaobhach. Rinneadh an turgnamh arís faoi dhó le torthaí comhchosúla. j Histogram minicíochta de threoshuíomh eitleáin roinnte cille an IPR timpeall P3 (glas éadrom), P4 (glas meánach), agus P5 (glas dorcha), faoi seach. Fuarthas luachanna P trí thástáil Kolmogorov-Smirnov déthaobhach. Rinneadh an turgnamh arís faoi dhó le torthaí comhchosúla.
Dá bhrí sin, rinneamar imscrúdú ina dhiaidh sin ar an gcomhghaol idir comharthaíocht GA agus gníomhaíocht roinnte cille trí bhallaí cille nua-fhoirmithe a aithint le linn na measúnachta (Fíor 5e). Chuir an cur chuige seo ar ár gcumas minicíocht agus treo roinnte cille a thomhas. Ar ionadh, fuarthas amach go raibh minicíocht roinnte cille san IPR agus sa chuid eile den SAM (neamh-IPR, Fíor 5f) cosúil, rud a léiríonn nach mbíonn tionchar suntasach ag difríochtaí i gcomharthaíocht GA idir cealla IPR agus neamh-IPR ar roinnt cille. Spreag sé seo, agus an comhghaol dearfach idir comharthaíocht GA agus ainiséatrópacht fáis, sinn chun machnamh a dhéanamh ar an bhféadfadh gníomhaíocht chomharthaíochta GA tionchar a imirt ar threoshuíomh phlána roinnte cille. Thomhaiseamar treoshuíomh bhalla na cille nua mar uillinn ghéar i gcoibhneas leis an ais gathach a nascann lár an mheiristeama agus lár bhalla na cille nua (Fíor 5e-i) agus thugamar faoi deara claonadh soiléir do chealla roinnt ag uillinneacha gar do 90° i gcoibhneas leis an ais gathach, agus na minicíochtaí is airde le feiceáil ag 70–80° (23.28%) agus 80–90° (22.62%) (Fíor 5e,i), arb ionann é agus roinnt cille sa treo imlíneach/trasnach (Fíor 5h). Chun scrúdú a dhéanamh ar rannchuidiú comharthaíocht GA leis an iompar roinnte cille seo, rinneamar anailís ar pharaiméadair roinnte cille san IPR agus san neamh-IPR ar leithligh (Fíor 5i). Thugamar faoi deara go raibh dáileadh uillinn roinnte i gcealla IPR difriúil ón méid i gcealla neamh-IPR nó i gcealla san SAM ar fad, agus cealla IPR ag taispeáint cion níos airde de roinnt cille cliathánacha/ciorclacha, i.e., 70–80° agus 80–90° (33.86% agus 30.71%, faoi seach, na cionúireachtaí comhfhreagracha) (Fíor 5i). Dá bhrí sin, léirigh ár mbreathnuithe comhlachas idir comharthaíocht GA ard agus treoshuíomh eitleáin roinnte cille gar don treo imlíneach, cosúil leis an gcomhghaol idir gníomhaíocht chomharthaíochta GA agus ainiséatrópacht fáis (Fíor 5c, d). Chun caomhnú spásúil an chomhlachais seo a bhunú tuilleadh, thomhaiseamar treoshuíomh eitleáin roinnte i gcealla IPR timpeall an phrímordiam ag tosú ó P3, ós rud é gur braitheadh an ghníomhaíocht chomharthaíochta GA is airde sa réigiún seo ag tosú ó P4 (Fíor 4). Níor léirigh uillinneacha roinnte an IPR timpeall P3 agus P4 aon difríochtaí suntasacha ó thaobh staitisticí de, cé gur breathnaíodh minicíocht mhéadaithe de roinnt cille cliathánacha san IPR timpeall P4 (Fíor 5j). Mar sin féin, sna cealla IPR timpeall P5, tháinig méadú mór ar an difríocht i dtreoshuíomh eitleán roinnte na gceall ó thaobh staitisticí de, le méadú géar ar mhinicíocht na ndeighiltí trasnacha cealla (Fíor 5j). Le chéile, tugann na torthaí seo le fios gur féidir le comharthaíocht GA treoshuíomh na ndeighiltí cealla sa SAM a rialú, rud atá comhsheasmhach le tuarascálacha roimhe seo40,41 gur féidir le comharthaíocht ard GA treoshuíomh cliathánach deighiltí cealla a spreagadh san IPR.
Táthar ag tuar nach ndéanfar cealla san IPR a ionchorprú sna primordia ach sna hinternóidí2,42,43. D’fhéadfadh treoshuíomh trasnach na rannán cille san IPR a bheith ina chúis le heagrú tipiciúil sraitheanna fadaimseartha comhthreomhara de chealla eipideirmeacha sna hinternóidí. Tugann ár mbreathnuithe a thuairiscítear thuas le fios go bhfuil ról ag comharthaíocht GA sa phróiseas seo trí threo na rannáin cille a rialáil.
Mar thoradh ar chailliúint feidhme roinnt géinte DELLA bíonn freagairt GA bunreachtúil ann, agus is féidir sócháin della a úsáid chun an hipitéis seo a thástáil44. Rinneamar anailís ar dtús ar phatrúin léirithe cúig ghéin DELLA sa SAM. Léirigh comhleá trascríobh na líne GUS45 gur léiríodh GAI, RGA, RGL1, agus RGL2 (go pointe i bhfad níos lú) sa SAM (Fíor Fhorlíontach 11a–d). Léirigh hibridiú in situ tuilleadh go mbailíonn mRNA GAI go sonrach i primordia agus i mbláthanna atá ag forbairt (Fíor Fhorlíontach 11e). Braitheadh mRNA RGL1 agus RGL3 ar fud cheannbhrat an SAM agus i mbláthanna níos sine, ach bhí mRNA RGL2 níos flúirseach sa réigiún teorann (Fíor Fhorlíontach 11f–h). Dheimhnigh íomháú comhfhócasach de pRGL3::RGL3-GFP SAM an léiriú a breathnaíodh trí hibridiú in situ agus léirigh sé go mbailíonn próitéin RGL3 sa chuid lárnach den SAM (Fíor Fhorlíontach 11i). Agus an líne pRGA::GFP-RGA á húsáid againn, fuarthas amach freisin go gcruann próitéin RGA sa SAM, ach go laghdaíonn a líonmhaireacht ag an teorainn ag tosú ó P4 (Fíor Fhorlíontach 11j). Is suntasach go bhfuil patrúin léirithe RGL3 agus RGA comhsheasmhach le gníomhaíocht chomharthaíochta GA níos airde san IPR, mar a bhraitear le qmRGA (Fíor 4). Thairis sin, léiríonn na sonraí seo go léirítear gach DELLA sa SAM agus go gclúdaíonn a léiriú le chéile an SAM ar fad.
Ansin rinneamar anailís ar na paraiméadair roinnte cille sa SAM cineál fiáin (Ler, rialú) agus sna sócháin chúigiúracha (domhanda) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (Fíor 6a, b). Is suimiúil gur thugamar faoi deara athrú suntasach go staitistiúil i ndáileadh minicíochtaí uillinn roinnte cille sa SAM sócháin della domhanda i gcomparáid leis an gcineál fiáin (Fíor 6c). Bhí an t-athrú seo sa sóchán della domhanda mar gheall ar mhéadú ar mhinicíocht uillinneacha 80–90° (34.71% vs. 24.55%) agus, go pointe níos lú, uillinneacha 70–80° (23.78% vs. 20.18%), i.e., a fhreagraíonn do roinnteanna trasnacha cille (Fíor 6c). Bhí minicíocht na roinnteanna neamh-thrasnacha (0–60°) níos ísle freisin sa sóchán della domhanda (Fíor 6c). Méadaíodh minicíocht na roinnteanna trasnacha cille go suntasach i SAM an tsócháin della domhanda (Fíor 6b). Bhí minicíocht na ndeighiltí cille trasnacha san IPR níos airde freisin sa mhúitant della global i gcomparáid leis an gcineál fiáin (Fíor 6d). Lasmuigh de réigiún IPR, bhí dáileadh níos aonfhoirmí d'uillinneacha deighilte cille ag an gcineál fiáin, ach b'fhearr leis an mhúitant della global deighiltí tadhlaíocha cosúil leis an IPR (Fíor 6e). Rinneamar cainníochtú freisin ar threoshuíomh na ndeighiltí cille i SAM na gcúig mhúitant ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, agus ga2ox6-2), cúlra múitant GA-neamhghníomhach ina gcarnaíonn GA. I gcomhréir leis an méadú i leibhéil GA, bhí SAM an chúigiú cuid de na bláthanna sóchánacha ga2ox níos mó ná SAM Col-0 (Fíor Fhorlíontach 12a, b), agus i gcomparáid le Col-0, léirigh an SAM cúigiú cuid ga2ox dáileadh difriúil ar fad d'uillinneacha roinnte cille, agus minicíocht na huillinne ag méadú ó 50° go 90°, i.e. arís i bhfabhar roinnte tadhlaíocha (Fíor Fhorlíontach 12a–c). Dá bhrí sin, taispeánaimid go spreagann gníomhachtú comharthaíochta GA agus carnadh GA roinnte cille cliathánacha san IPR agus sa chuid eile den SAM.
a, b Amharcléiriú 3T ar shraith L1 SAM Ler (a) daite le PI agus SAM sóchán della domhanda (b) ag baint úsáide as micreascópacht chomhfhócasach. Taispeántar ballaí cealla nua a foirmíodh sa SAM (ach ní sa phrímordiam) thar thréimhse 10 n-uaire an chloig agus tá siad daite de réir a luachanna uillinne. Taispeánann an t-ionchur an SAM ag 0 uair an chloig. Taispeántar an barra datha sa chúinne íochtarach ar dheis. Léiríonn an tsaighead i (b) sampla de chomhaid chealla ailínithe sa sóchán della domhanda. Rinneadh an turgnamh a athdhéanamh faoi dhó le torthaí comhchosúla. comparáid ce ar dháileadh minicíochta threoshuíomhanna eitleáin roinnte cille sa SAM iomlán (d), IPR (e), agus neamh-IPR (f) idir Ler agus della domhanda. Fuarthas luachanna P ag baint úsáide as tástáil Kolmogorov-Smirnov dhá-eireaballach. f, g Amharcléiriú 3T ar íomhánna comhfhócasacha de SAM daite le PI de phlandaí trasghéineacha Col-0 (i) agus pCUC2::gai-1-VENUS (j). Léiríonn painéil (a, b) ballaí cealla nua (ach ní primordia) a foirmíodh sa SAM laistigh de 10 uair an chloig. Rinneadh an turgnamh faoi dhó le torthaí comhchosúla. h–j Comparáid idir dáileadh minicíochta threoshuíomhanna eitleáin roinnte cealla atá suite sa SAM iomlán (h), IPR (i) agus neamh-IPR (j) idir plandaí Col-0 agus pCUC2::gai-1-VENUS. Fuarthas luachanna P ag baint úsáide as tástáil dhá-eireaballach Kolmogorov–Smirnov.
Ansin rinneamar tástáil ar éifeacht chosc comharthaíocht GA go sonrach san IPR. Chun na críche seo, d'úsáideamar an promotor cupán cotyledon 2 (CUC2) chun léiriú próitéine gai-1 ceannasach diúltach atá comhleáite le VENUS (sa líne pCUC2::gai-1-VENUS) a thiomáint. Sa SAM cineál fiáin, tiomáineann an promotor CUC2 léiriú an chuid is mó de na IPRanna sa SAM, lena n-áirítear cealla teorann, ó P4 ar aghaidh, agus breathnaíodh léiriú sonrach comhchosúil i bplandaí pCUC2::gai-1-VENUS (féach thíos). Ní raibh dáileadh uillinneacha roinnte cille trasna SAM nó IPR plandaí pCUC2::gai-1-VENUS difriúil go suntasach ó dháileadh an chineáil fhiáin, cé gur aimsíomar go gan choinne gur roinn cealla gan IPR sna plandaí seo ag minicíocht níos airde de 80–90° (Fíor 6f–j).
Moltar go mbraitheann treo na roinnte cille ar gheoiméadracht an SAM, go háirithe an strus teanntachta a ghintear ag cuar na fíocháin46. Dá bhrí sin, d'fhiafraíomar an raibh cruth an SAM athraithe sna plandaí della global mutant agus pCUC2::gai-1-VENUS. Mar a tuairiscíodh roimhe seo12, bhí méid an SAM della global mutant níos mó ná méid an chineáil fhiáin (Fíor Forlíontach 13a, b, d). Dheimhnigh hibridiú in situ CLV3 agus RNA STM leathnú an mheristéime i mutants della agus léirigh sé leathnú cliathánach nideoige an chealla gas freisin (Fíor Forlíontach 13e, f, h, i). Mar sin féin, bhí cuar an SAM cosúil sa dá ghéinitíopa (Fíor Forlíontach 13k, m, n, p). Thugamar faoi deara méadú comhchosúil i méid sa cheathrú-mhútant gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della gan athrú ar an gcuar i gcomparáid leis an gcineál fiáin (Fíor Forlíontach 13c, d, g, j, l, o, p). Bhí tionchar ag minicíocht threoshuíomh roinnte cille sa mhúitant ceithre huaire della freisin, ach go pointe níos lú ná sa mhúitant monailiteach della (Fíor Fhorlíontach 12d–f). Tugann an éifeacht dáileoige seo, mar aon leis an easpa éifeachta ar chuar, le fios go gcuireann gníomhaíocht iarmharach RGL3 sa mhúitant ceithre huaire Della teorainn le hathruithe i dtreoshuíomh roinnte cille de bharr cailliúint gníomhaíochta DELLA agus go dtarlaíonn athruithe i roinnte cille cliathánacha mar fhreagairt ar athruithe i ngníomhaíocht chomharthaíochta GA seachas athruithe i ngeoiméadracht SAM. Mar a thuairiscítear thuas, tiomáineann an promotor CUC2 léiriú IPR sa SAM ag tosú ag P4 (Fíor Fhorlíontach 14a, b), agus i gcodarsnacht leis sin, bhí méid laghdaithe ach cuar níos airde ag SAM pCUC2::gai-1-VENUS (Fíor Fhorlíontach 14c–h). D’fhéadfadh an t-athrú seo i moirfeolaíocht SAM pCUC2::gai-1-VENUS a bheith ina chúis le dáileadh difriúil strusanna meicniúla i gcomparáid leis an gcineál fiáin, ina dtosaíonn strusanna imlíne arda ag achar níos giorra ó lár SAM47. Nó ar shlí eile, d’fhéadfadh na hathruithe i moirfeolaíocht pCUC2::gai-1-VENUS SAM a bheith mar thoradh ar athruithe i n-airíonna meicniúla réigiúnacha de bharr léiriú trasghéine48. Sa dá chás, d’fhéadfadh sé seo éifeachtaí na n-athruithe i gcomharthaíocht GA a fhritháireamh go páirteach tríd an dóchúlacht go roinnfidh cealla sa treoshuíomh imlíneach/trasnach a mhéadú, rud a mhíníonn ár mbreathnuithe.
Le chéile, dearbhaíonn ár sonraí go bhfuil ról gníomhach ag comharthaíocht GA níos airde i dtreoshuíomh cliathánach an eitleáin deighilte cille san IPR. Taispeánann siad freisin go mbíonn tionchar ag cuar an mheristéime ar threoshuíomh an eitleáin deighilte cille san IPR freisin.
Tugann treoshuíomh trasnach an eitleáin roinnte san IPR, mar gheall ar ghníomhaíocht ard comharthaíochta GA, le fios go réamh-eagraíonn GA comhad cealla gathach san eipideirm laistigh den SAM chun an eagrú ceallach a gheofar níos déanaí san internod eipideirmeach a shainiú. Go deimhin, bhí comhaid chealla den sórt sin le feiceáil go minic in íomhánna SAM de mhútaintigh della global (Fíor 6b). Dá bhrí sin, chun feidhm fhorbartha patrún spásúil comharthaíochta GA san SAM a iniúchadh tuilleadh, d'úsáideamar íomháú am-imeachta chun eagrú spásúil cealla san IPR i bplandaí trasghéineacha cineál fiáin (Ler agus Col-0), mútaintigh della global, agus pCUC2::gai-1-VENUS a anailísiú.
Fuaireamar amach gur léirigh qmRGA gur mhéadaigh gníomhaíocht chomharthaíochta GA san IPR ó P1/P2 agus gur shroich sí buaic ag P4, agus gur fhan an patrún seo tairiseach le himeacht ama (Fíor 4a–f agus Fíor Fhorlíontach 8c–f, k). Chun eagrú spásúil na gcealla san IPR a anailísiú le comhartha GA méadaitheach, lipéadaíomar cealla Ler IPR os cionn agus ar thaobhanna P4 de réir a gcinniúint forbartha a ndearnadh anailís orthu 34 uair an chloig tar éis an chéad bhreathnóireachta, i.e., níos mó ná dhá am plaistide, rud a ligeann dúinn cealla IPR a leanúint le linn fhorbairt an phrímordiam ó P1/P2 go P4. D'úsáideamar trí dhath éagsúla: buí do na cealla sin a comhtháthaíodh isteach sa phrímordiam in aice le P4, glas dóibh siúd a bhí san IPR, agus corcra dóibh siúd a ghlac páirt sa dá phróiseas (Fíor 7a–c). Ag t0 (0 h), bhí 1–2 shraith de chealla IPR le feiceáil os comhair P4 (Fíor 7a). Mar a bhíothas ag súil leis, nuair a roinn na cealla seo, rinne siad amhlaidh den chuid is mó tríd an eitleán roinnte trasnach (Fíor 7a–c). Fuarthas torthaí comhchosúla ag baint úsáide as Col-0 SAM (ag díriú ar P3, a bhfuil a theorainn fillte ar bhealach cosúil le P4 i Ler), cé gur cheil an fillteán a foirmíodh ag an teorainn bláthanna na cealla IPR níos tapúla sa ghéinitíopa seo (Fíor 7g–i). Dá bhrí sin, réamh-eagraíonn patrún roinnte cealla IPR na cealla i sraitheanna gathacha, mar atá in internóidí. Tugann eagrú na sraitheanna gathacha agus suíomh cealla IPR idir orgáin chomhleanúnacha le fios gur sinsir internóideacha iad na cealla seo.
Anseo, d'fhorbraíomar bithbhraiteoir comharthaíochta GA cóimheasach, qmRGA, a cheadaíonn mapáil chainníochtúil ar ghníomhaíocht chomharthaíochta GA a eascraíonn as tiúchain GA agus gabhdóirí GA comhcheangailte agus cur isteach ar chonairí comharthaíochta inchríneacha á íoslaghdú, rud a sholáthraíonn faisnéis faoi fheidhm GA ag an leibhéal ceallach. Chun na críche sin, thógamar próitéin DELLA modhnaithe, mRGA, a chaill an cumas chun ceangal le comhpháirtithe idirghníomhaíochta DELLA ach atá fós íogair do phróitéalas spreagtha ag GA. Freagraíonn qmRGA d'athruithe eisigineacha agus inchríneacha araon i leibhéil GA, agus cuireann a airíonna braite dinimiciúla ar chumas measúnú a dhéanamh ar athruithe spásama agus ama i ngníomhaíocht chomharthaíochta GA le linn forbartha. Is uirlis an-solúbtha é qmRGA freisin mar is féidir é a oiriúnú do fhíocháin éagsúla tríd an tionscnóir a úsáidtear dá léiriú a athrú (más gá), agus i bhfianaise nádúr caomhnaithe an chonair chomharthaíochta GA agus an mhóitíf PFYRE trasna angiosperms, is dócha go mbeidh sé inaistrithe chuig speicis eile22. Ag teacht leis seo, léiríodh freisin go gcuireann sóchán coibhéiseach i bpróitéin ríse SLR1 DELLA (HYY497AAA) cosc ar ghníomhaíocht choscóra fáis SLR1 agus nach laghdaíonn sé ach beagán a dhíghrádú GA-idirghabhálaithe, cosúil le mRGA23. Is suntasach gur léirigh staidéir le déanaí in Arabidopsis gur athraigh sóchán aimínaigéid aonair i bhfearann PFYRE (S474L) gníomhaíocht thrascríobh RGA gan cur isteach ar a chumas idirghníomhú le comhpháirtithe fachtóirí trascríobh50. Cé go bhfuil an sóchán seo an-ghar do na 3 ionadú aimínaigéid atá i láthair i mRGA, léiríonn ár staidéir go n-athraíonn an dá shóchán seo tréithe ar leith DELLA. Cé go gceanglaíonn formhór na gcomhpháirtithe fachtóirí trascríobh le fearainn LHR1 agus SAW DELLA26,51, d'fhéadfadh roinnt aimínaigéid chaomhnaithe i bhfearann PFYRE cabhrú leis na hidirghníomhaíochtaí seo a chobhsú.
Is tréith ríthábhachtach in ailtireacht plandaí agus i bhfeabhsú toradh í forbairt internod. Léirigh qmRGA gníomhaíocht chomharthaíochta GA níos airde i gcealla progenitor internod IPR. Trí íomháú cainníochtúil agus géineolaíocht a chomhcheangal, thaispeánamar go gcuireann patrúin chomharthaíochta GA plánaí deighilte cille ciorclacha/trasnacha i bhfeidhm san eipideirm SAM, ag cruthú eagrúchán na deighilte cille atá riachtanach le haghaidh forbairt internod. Aithníodh roinnt rialtóirí ar threoshuíomh plána deighilte cille le linn na forbartha52,53. Soláthraíonn ár gcuid oibre sampla soiléir de conas a rialaíonn gníomhaíocht chomharthaíochta GA an paraiméadar ceallach seo. Is féidir le DELLA idirghníomhú le coimpléisc próitéine réamhfhillte41, mar sin féadfaidh comharthaíocht GA treoshuíomh plána deighilte cille a rialáil trí thionchar díreach a imirt ar threoshuíomh micreatubúl cortex40,41,54,55. Thaispeánamar go gan choinne i SAM, nach raibh comhghaol idirghníomhaíochta GA níos airde ná fadú nó deighilt cille, ach ainisotrópacht fáis amháin, rud atá comhsheasmhach le héifeacht dhíreach GA ar threo na deighilte cille san IPR. Mar sin féin, ní féidir linn a eisiamh go bhféadfadh an éifeacht seo a bheith indíreach freisin, mar shampla trí mhaolú balla cille spreagtha ag GA56. Spreagann athruithe i airíonna bhalla cille strus meicniúil57,58, rud a d’fhéadfadh tionchar a imirt freisin ar threoshuíomh eitleáin roinnte na gceall trí thionchar a imirt ar threoshuíomh na micreatubúl cortex39,46,59. D’fhéadfadh tionchar comhcheangailte struis mheicniúil spreagtha ag GA agus rialáil dhíreach ar threoshuíomh micreatubúl ag GA a bheith páirteach i bpatrún sonrach de threoshuíomh roinnte cille a ghiniúint san IPR chun internóid a shainiú, agus tá gá le tuilleadh staidéar chun an smaoineamh seo a thástáil. Ar an gcaoi chéanna, tá tábhacht na bpróitéiní idirghníomhaíochta DELLA TCP14 agus 15 i rialú foirmiú internóid60,61 agus d’fhéadfadh na tosca seo gníomh GA a idirghabháil mar aon le BREVIPEDICELLUS (BP) agus PENNYWISE (PNY), a rialaíonn forbairt internóid agus a léiríodh go mbíonn tionchar acu ar chomharthaíocht GA2,62. Ós rud é go n-idirghníomhaíonn DELLAs le conairí comharthaíochta brassinosteroid, eitiléin, aigéad jasmonic, agus aigéad abscisic (ABA)63,64 agus gur féidir leis na hormóin seo tionchar a imirt ar threoshuíomh micreatubúl65, d’fhéadfadh hormóin eile idirghabháil a dhéanamh i dtionchair GA ar threoshuíomh roinnte cille freisin.
Léirigh staidéir luatha cíteolaíocha go bhfuil gá le réigiúin istigh agus sheachtracha SAM Arabidopsis le haghaidh forbairt internod2,42. Tacaíonn an fhíric go rialaíonn GA go gníomhach deighilt cille sna fíocháin istigh12 le feidhm dhúbailte GA maidir le méid meiristéime agus internod a rialáil sa SAM. Tá patrún na deighilte cille treorach rialaithe go docht freisin sa fhíochán SAM istigh, agus tá an rialáil seo riachtanach le haghaidh fás gas52. Beidh sé suimiúil scrúdú a dhéanamh an bhfuil ról ag GA freisin i dtreorú an eitleáin deighilte cille in eagrú inmheánach an SAM, rud a shioncrónaíonn sonraíocht agus forbairt internods laistigh den SAM.
Fásadh plandaí in vitro in ithir nó i meán 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) a raibh 1% siúcrós agus 1% agar (Sigma) curtha leis faoi choinníollacha caighdeánacha (16 uair an chloig de sholas, 22 °C), seachas i gcás turgnaimh fáis hipeacotaile agus fréimhe inar fásadh síológa ar phlátaí ingearacha faoi sholas tairiseach agus 22 °C. I gcás turgnaimh níotráite, fásadh plandaí ar mheán MS modhnaithe (meán plandaí bioWORLD) a raibh níotráit leordhóthanach (0 nó 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% siúcrós agus 1% A-agar (Sigma) curtha leis faoi choinníollacha lae fada.
Rinneadh cDNA GID1a a cuireadh isteach i pDONR221 a athcheangal le pDONR P4-P1R-pUBQ10 agus pDONR P2R-P3-mCherry i pB7m34GW chun pUBQ10::GID1a-mCherry a ghiniúint. Rinneadh DNA IDD2 a cuireadh isteach i pDONR221 a athcheangal i pB7RWG266 chun p35S:IDD2-RFP a ghiniúint. Chun pGID1b::2xmTQ2-GID1b a ghiniúint, rinneadh blúire 3.9 kb suas srutha ón réigiún códaithe GID1b agus blúire 4.7 kb ina raibh cDNA GID1b (1.3 kb) agus críochnóir (3.4 kb) a aimpliú ar dtús ag baint úsáide as na tosaitheoirí i dTábla Forlíontach 3 agus ansin cuireadh isteach iad i pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) agus pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), faoi seach, agus ar deireadh athcheanglaíodh iad le pDONR221 2xmTQ268 isteach sa veicteoir sprice pGreen 012567 ag baint úsáide as clónáil Gateway. Chun pCUC2::LSSmOrange a ghiniúint, cuireadh seicheamh tionscnóra CUC2 (3229 bp suas srutha ó ATG) agus ina dhiaidh sin seicheamh códaithe mOrange mór aistrithe Stokes (LSSmOrange)69 leis an gcomhartha logánaithe núicléach N7 agus an críochnóir trascríobh NOS le chéile sa veicteoir spriocdhírithe kanamycin pGreen ag baint úsáide as an gcóras athchuingrithe 3-blúire Gateway (Invitrogen). Tugadh an veicteoir dénártha plandaí isteach i strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 agus tugadh isteach é i nduilleoga Nicotiana benthamiana tríd an modh insíothlaithe Agrobacterium agus isteach in Arabidopsis thaliana Col-0 tríd an modh tumtha bláthanna, faoi seach. Aonraíodh pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry agus pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ó shliocht F3 agus F1 na gcrosanna faoi seach, faoi seach.
Rinneadh hibridiú RNA in situ ar bharra péacán thart ar 1 cm ar fhad72, a bailíodh agus a socraíodh láithreach i dtuaslagán FAA (3.7% formaildéad, 5% aigéad aicéiteach, 50% eatánól) réamhfhuaraithe go 4 °C. Tar éis cóireálacha folúis 2 × 15 nóiméad, athraíodh an socraitheoir agus goradh na samplaí thar oíche. Sintéisíodh cDNAanna GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, agus RGL3 agus tóireadóirí frithchiallacha dá 3′-UTRanna ag baint úsáide as na tosaitheoirí a thaispeántar i dTábla Forlíontach 3 mar a thuairiscigh Rosier et al.73. Rinneadh imdhíon-bhrathadh ar tóireadóirí lipéadaithe le digoxigenin ag baint úsáide as antashubstaintí digoxigenin (caolú 3000 uair; Roche, uimhir chatalóige: 11 093 274 910), agus rinneadh na codanna a dhaite le tuaslagán 5-bróma-4-clóra-3-indóilile fosfáit (BCIP, caolú 250 uair)/nítreabórm teitreasóiliam (NBT, caolú 200 uair).
Am an phoist: 10 Feabhra 2025