Tá fás mairisteam aipiciúil shoot (SAM) ríthábhachtach don ailtireacht gas. Hormóin plandaígibberellinsTá príomhróil ag (GAnna) maidir le fás plandaí a chomhordú, ach níl tuiscint mhaith fós ar a ról sa SAM. Anseo, d'fhorbraíomar bithbhraiteoir cóimheasmhéadrach de chomharthaíocht GA trí phróitéin DELLA a innealtóireacht chun a fheidhm riachtanach rialála a chosc i bhfreagra tras-scríofa GA agus a dhíghrádú ar aitheantas GA a chaomhnú. Léirímid go ndéanann an bithbhraiteoir díghrádaithe seo taifead cruinn ar athruithe i leibhéil GA agus braiteadh ceallacha le linn forbartha. D’úsáideamar an bithbhraiteoir seo chun gníomhaíocht comharthaíochta GA a mhapáil sa SAM. Léirímid go bhfuil comharthaí GA arda i láthair go príomha i gcealla atá suite idir orgán primordia, atá ina réamhtheachtaithe do chealla internode. Ag baint úsáide as cur chuige gnóthachain agus caillteanas-feidhme, léirímid freisin go rialaíonn GA treoshuíomh an eitleáin rannán cille, ag bunú eagraíocht chanónach cheallacha na n-idirnodes, agus ar an gcaoi sin sonraíocht idirnóid a chur chun cinn sa SAM.
Tá nideoige de ghaschealla sa mhéistéama apical púg (SAM), atá suite ag APEX an phéacóige, a gineann a ngníomhaíocht orgáin cliathánach agus nóid ghais ar mhodh modúlach agus atriallach ar feadh shaolré an phlanda. Áirítear i ngach ceann de na haonaid athfhillteacha seo, nó nóid phlanda, internodes agus orgáin cliathánach ag na nóid, agus míristéamaí axillary in aicsil na nduilleog1. Athraíonn fás agus eagrú nóid plandaí le linn forbartha. I Arabidopsis, cuirtear fás internodal faoi chois le linn na céime fásúla, agus fanann meristems axillary díomhaoin i axils duilleoga rosette. Le linn an aistrithe go dtí an chéim bláthanna, déantar an SAM mar mhéistéama inflorescence, ag giniúint internodes fadaithe agus bachlóga axillary, branchlets in axils duilleoga cauline, agus ina dhiaidh sin, bláthanna gan duilleoga2. Cé go bhfuil dul chun cinn suntasach déanta againn maidir le tuiscint a fháil ar na meicníochtaí a rialaíonn tionscnamh duilleoga, bláthanna agus brainsí, is beag atá ar eolas faoi conas a thagann internodes chun cinn.
Cabhróidh tuiscint ar dháileadh spatiotemporal GAanna le tuiscint níos fearr a fháil ar fheidhmeanna na n-hormóin seo i bhfíocháin éagsúla agus ag céimeanna forbartha éagsúla. Soláthraíonn léirshamhlú ar dhíghrádú an chomhleá RGA-GFP arna chur in iúl faoi ghníomhaíocht a thionscnóra féin faisnéis thábhachtach maidir le rialáil leibhéil iomlána GA sna fréamhacha15,16. Mar sin féin, athraíonn slonn RGA trasna fíocháin17 agus rialaítear é ag GA18. Mar sin, d’fhéadfadh an patrún fluaraiseachta a breathnaíodh le RGA-GFP a bheith mar thoradh ar léiriú difreálach ar thionscnóir RGA agus mar sin níl an modh seo cainníochtúil. Le déanaí, léirigh GA19,20 lipéadaithe fluaraiséis bithghníomhach (Fl) carnadh GA sa fhréamh-endocortex agus rialáil a leibhéil cheallacha trí iompar GA. Le déanaí, léirigh an braiteoir GA FRET nlsGPS1 go bhfuil comhghaol idir leibhéil GA agus fadú cille i bhfréamhacha, i bhfiliméid, agus i bhfiocotailí dorcha21. Mar atá feicthe againn, áfach, ní hé tiúchan GA an t-aon pharaiméadar a rialaíonn gníomhaíocht comharthaíochta GA, toisc go mbraitheann sé ar phróisis braite casta. Anseo, ag tógáil ar ár dtuiscint ar bhealaí comharthaíochta DELLA agus GA, tuairiscímid forbairt agus tréithriú bithbhraiteora cóimheasmhéadrach bunaithe ar dhíghrádú do chomharthaíocht GA. Chun an bithbhraiteoir cainníochtúil seo a fhorbairt, d'úsáideamar RGA mutant GA-íogair a bhí comhleádh le próitéin fluaraiseacha agus a cuireadh in iúl go hiomlán i bhfíocháin, chomh maith le próitéin fluaraiseacha GA-neamhíogair. Léirímid nach gcuireann na comhleá próitéin RGA mutant isteach ar chomharthaíocht GA ingenous nuair a chuirtear in iúl go uileláithreach é, agus gur féidir leis an bithbhraiteoir seo gníomhaíocht chomharthaíochta a eascraíonn as ionchur GA agus próiseáil comhartha GA araon a chainníochtú ag an gaireas braite le taifeach spásúlachta ard. D’úsáideamar an bithbhraiteoir seo chun dáileadh spásúil na gníomhaíochta comharthaíochta GA a mhapáil agus chun an chaoi a rialaíonn GA iompar ceallach san eipideirm SAM a chainníochtú. Léirímid go rialaíonn GA treoshuíomh an phlána rannáin de chealla SAM atá suite idir orgán primordia, agus ar an gcaoi sin sainítear eagraíocht cheallacha canónacha an internode.
Mar fhocal scoir, d'fhiafraigh muid an bhféadfadh qmRGA athruithe ar leibhéil GA ingenous a thuairisciú trí úsáid a bhaint as hipocotyls atá ag fás. Léirigh muid roimhe seo go spreagann níotráit fás trí shintéis GA a mhéadú agus, ar a seal, díghrádú DELLA34. Dá réir sin, thugamar faoi deara go raibh fad hypocotyl i pUBQ10::síológa qmRGA a fhástar faoi sholáthar níotráite flúirseach (10 mm NO3 -) i bhfad níos faide ná sin i síológa a fhástar faoi choinníollacha easnamhach níotráite (Fíor Fhorlíontach Fig. 6a). Ag teacht leis an bhfreagairt fáis, bhí comharthaí GA níos airde i hipocotyls na síológa a fhástar faoi 10 mM NO3 - coinníollacha ná i síológa a fhástar in éagmais níotráite (Fíor Forlíontach 6b, c). Mar sin, cumasaíonn qmRGA freisin monatóireacht a dhéanamh ar athruithe ar chomharthaíocht GA de bharr athruithe ingineacha i dtiúchan GA.
Chun a thuiscint an bhfuil gníomhaíocht comharthaíochta GA a bhraith qmRGA ag brath ar thiúchan GA agus ar aireachtáil GA, mar a bhíothas ag súil leis bunaithe ar dhearadh an bhraiteora, rinneamar anailís ar léiriú na dtrí ghabhdóir GID1 i bhfíocháin fhásúla agus atáirgthe. I síológa, léirigh an líne tuairisceoir GID1-GUS go raibh GID1a agus c in iúl go mór i cotyledons (Fíor 3a-c). Ina theannta sin, cuireadh na trí gabhdóirí in iúl i duilleoga, primordia fréimhe cliathánach, leideanna fréimhe (ach amháin i gcás an caipín fréimhe GID1b), agus an córas soithíoch (Fig. 3a-c). Sa inflorescence SAM, níor bhraitheamar comharthaí GUS ach le haghaidh GID1b agus 1c (Fíor Forlíontach 7a–c). Dheimhnigh hibridiú in situ na patrúin slonn seo agus léirigh sé freisin go raibh GID1c curtha in iúl go haonfhoirmeach ag leibhéil ísle sa SAM, ach léirigh GID1b léiriú níos airde ar imeall an SAM (Fíor Forlíontach 7d-l). Nocht an comhleá aistritheach pGID1b::2xmTQ2-GID1b raon grádaithe slonn GID1b, ó slonn íseal nó gan aon slonn i lár an SAM go dtí slonn ard ag teorainneacha na n-orgán (Fíor Forlíontach 7m). Mar sin, ní dhéantar gabhdóirí GID1 a dháileadh go haonfhoirmeach ar fud fíocháin agus laistigh díobh. I dturgnaimh ina dhiaidh sin, thugamar faoi deara freisin gur mhéadaigh ró-léiriú GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) íogaireacht qmRGA i hipocatyls maidir le feidhmiú GA seachtrach (Fíor 3d, e). I gcodarsnacht leis sin, bhí an fhluaraiseacht arna thomhas ag qd17mRGA sa hypocotyl neamhíogair do chóireáil GA3 (Fíor 3f, g). Maidir leis an dá mheasúnú, déileáladh le síológa le tiúchain arda GA (100 μM GA3) chun iompar tapa an bhraiteora a mheas, áit ar feabhsaíodh nó cailleadh an cumas chun ceangal a dhéanamh leis an ngabhdóir GID1. Le chéile, deimhníonn na torthaí seo go bhfreastalaíonn biosensor qmRGA feidhm chomhcheangailte mar braiteoir GA agus GA, agus tugann siad le fios gur féidir le léiriú difreálach an receptor GID1 emissivity an braiteora a mhodhnú go suntasach.
Go dtí seo, tá dáileadh na gcomharthaí GA sa SAM doiléir fós. Mar sin, d'úsáideamar gléasraí qmRGA-léirithe agus an pCLV3::mCherry-NLS tuairisceoir gascheall35 chun léarscáileanna cainníochtúla ardtaifigh de ghníomhaíocht comharthaíochta GA a ríomh, ag díriú ar an gciseal L1 (eipideirm; Fíor 4a, b, féach Modhanna agus Modhanna Forlíontacha), ós rud é go bhfuil ról lárnach ag L1 maidir le fás SAM a rialú36. Anseo, sholáthair slonn pCLV3::mCherry-NLS pointe tagartha seasta geoiméadrach chun anailís a dhéanamh ar dháileadh spásúlachta na gníomhaíochta comharthaíochta GA37. Cé go meastar go bhfuil GA riachtanach d'fhorbairt orgáin cliathánach4, thugamar faoi deara go raibh comharthaí GA íseal sa primordium bláthanna (P) ag tosú ón gcéim P3 (Fíor 4a, b), ach bhí gníomhaíocht mheasartha ag primordiums óga P1 agus P2 cosúil leis an gceann sa réigiún lárnach (Fíor 4a, b). Braitheadh gníomhaíocht comharthaíochta GA níos airde ag teorainneacha primordium an orgáin, ag tosú ag P1/P2 (ar thaobh na teorann) agus ag buaicphointe ag P4, chomh maith le i ngach cealla den réigiún forimeallach atá suite idir an primordia (Fíor 4a, b agus Fíor Fhorlíontach 8a, b). Breathnaíodh an ghníomhaíocht chomharthaíochta GA níos airde seo, ní hamháin san eipideirm ach freisin sna sraitheanna L2 agus uachtaracha L3 (Fíor Forlíontach 8b). Níor tháinig aon athrú ar phatrún na gcomharthaí GA a braitheadh sa SAM ag baint úsáide as qmRGA le himeacht ama (Fíor Forlíontach 8c–f, k). Cé gur laghdaíodh an tógáil qd17mRGA go córasach i SAM de phlandaí T3 ó chúig líne neamhspleácha ar shaintréithe muid go mion, bhíomar in ann anailís a dhéanamh ar na patrúin fhluaraiseachta a fuarthas leis an pRPS5a::VenUS-2A-TagBFP construct (Fíor Forlíontach 8g–j, l). Sa líne rialaithe seo, níor aimsíodh ach mionathruithe ar an gcóimheas fluaraiseachta sa SAM, ach san ionad SAM thugamar faoi deara laghdú soiléir gan choinne i Véineas a bhaineann le TagBFP. Deimhníonn sé seo go léiríonn an patrún comharthaíochta a bhreathnaíonn qmRGA díghrádú GA-spleách ar mRGA-Véineas, ach léiríonn sé freisin go bhféadfadh qmRGA rómheastachán a dhéanamh ar ghníomhaíocht comharthaíochta GA sa lárionad míristéama. Go hachomair, léiríonn ár dtorthaí patrún comharthaíochta GA a léiríonn go príomha dáileadh primordia. Tá an dáileadh seo den réigiún idir-primordial (IPR) mar gheall ar ghníomhaíocht comharthaíochta ard GA a bhunú de réir a chéile idir an primordium atá ag forbairt agus an réigiún lárnach, agus ag an am céanna laghdaítear gníomhaíocht comharthaíochta GA sa primordium (Fíor 4c, d).
Tugann dáileadh gabhdóirí GID1b agus GID1c (féach thuas) le fios go gcuidíonn léiriú difreálach ar ghabhdóirí GA le patrún gníomhaíochta comharthaíochta GA a mhúnlú sa SAM. N’fheadar an bhféadfadh carnadh difreálach GA a bheith i gceist. Chun an fhéidearthacht seo a imscrúdú, d'úsáideamar an braiteoir nlsGPS1 GA FRET21. Braitheadh minicíocht gníomhachtaithe méadaithe i SAM de nlsGPS1 cóireáilte le 10 μM GA4+7 ar feadh 100 nóiméad (Fíor Forlíontach 9a-e), rud a léiríonn go bhfreagraíonn nlsGPS1 d'athruithe i dtiúchan GA sa SAM, mar a dhéanann sé i roots21. Léirigh dáileadh spásúil minicíocht gníomhachtaithe nlsGPS1 leibhéil GA réasúnta íseal i sraitheanna seachtracha an SAM, ach léirigh sé go raibh siad ardaithe sa lár agus ag teorainneacha an SAM (Fíor 4e agus Fíor Forlíontach 9a,c). Tugann sé seo le tuiscint go bhfuil GA scaipthe freisin sa SAM le patrún spásúil atá inchomparáide leis an gceann a nochtar ag qmRGA. Mar chur chuige comhlántach, chaitheamar freisin leis an SAM le fluaraiseacha GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) nó Fl ina n-aonar mar rialú diúltach. Dáileadh an comhartha Fl ar fud SAM, lena n-áirítear an réigiún lárnach agus primordium, cé go raibh sé ag déine níos ísle (Fíor 4j agus Fíor Forlíontach 10d). I gcodarsnacht leis sin, carnaíodh na trí GA-Fl go sonrach laistigh de na teorainneacha primordium agus go céimeanna éagsúla sa chuid eile den IPR, agus GA7-Fl ag carnadh sa réimse is mó san IPR (Fíor 4k agus Fíor Forlíontach 10a,b). Léirigh cainníochtú déine fluaraiseachta go raibh an cóimheas déine IPR le neamh-IPR níos airde i SAM cóireáilte le GA-Fl i gcomparáid le SAM cóireáilte le F (Fíor 4l agus Fíor Forlíontach Fíor. 10c). Le chéile, tugann na torthaí seo le fios go bhfuil GA i láthair ag tiúchan níos airde i gcealla IPR atá suite is gaire don teorainn orgán. Tugann sé seo le tuiscint go dtagann patrún gníomhaíochta comharthaíochta SAM GA as léiriú difreálach gabhdóirí GA agus carnadh difreálach GA i gcealla IPR gar do theorainneacha orgán. Mar sin, léirigh ár n-anailís patrún spatiotemporal de chomharthaíocht GA gan choinne, le gníomhaíocht níos ísle i lár agus primordium an SAM agus gníomhaíocht níos airde san IPR sa réigiún forimeallach.
Chun ról na gníomhaíochta comharthaíochta difreálach GA sa SAM a thuiscint, rinneamar anailís ar an gcomhghaol idir gníomhaíocht comharthaíochta GA, leathnú cille, agus rannán cille ag baint úsáide as íomháú imeacht ama fíor-ama den SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. I bhfianaise ról GA i rialáil fáis, bhíothas ag súil le comhghaol dearfach le paraiméadair leathnú cille. Dá bhrí sin, rinneamar comparáid ar dtús le léarscáileanna gníomhaíochta comharthaíochta GA le léarscáileanna de ráta fáis dromchla cille (mar seachfhreastalaí do neart leathnú cille do chill ar leith agus do chealla iníon ag rannán) agus le léarscáileanna d'anisotrópacht fáis, a thomhaiseann treoiúlacht leathnú cille (a úsáidtear anseo freisin le haghaidh cille ar leith agus le haghaidh cealla iníon ag roinnt; Fíor 5a,b, féach Modhanna agus Modhanna Forlíontacha). Tá ár léarscáileanna de ráta fáis dromchla cille SAM comhsheasmhach le breathnuithe roimhe seo38,39, le rátaí fáis íosta ag an teorainn agus rátaí uasta fáis i bhforbairt bláthanna (Fíor 5a). Léirigh anailís phríomh-chomhpháirt (PCA) go raibh comhghaol diúltach idir gníomhaíocht comharthaíochta GA agus déine fáis dromchla cille (Fíor 5c). Léirigh muid freisin go raibh na príomh-aiseanna éagsúlachta, lena n-áirítear ionchur comharthaíochta GA agus déine fáis, orthogonal leis an treo a chinntear le léiriú ard CLV3, ag deimhniú eisiamh cealla ón ionad SAM sna hanailísí atá fágtha. Dhearbhaigh anailís comhghaoil Spearman na torthaí PCA (Fíor 5d), rud a léiríonn nach raibh comharthaí GA níos airde san IPR mar thoradh ar leathnú cille níos airde. Mar sin féin, léirigh anailís comhghaolaithe comhghaol beag dearfach idir gníomhaíocht comharthaíochta GA agus anisotrópacht fáis (Fíor 5c, d), rud a thugann le tuiscint go mbíonn tionchar ag comharthaíocht GA níos airde san IPR ar threo fás cille agus b'fhéidir suíomh an eitleáin rannán cille.
a, b Bhí meánléarscáileanna teasa den mheánfhás dromchla (a) agus aniseatrópachta fáis (b) i SAM níos mó ná seacht ngléasra neamhspleácha (a úsáidtear mar sheachvótálaithe le haghaidh neart agus treo leathnú cille, faoi seach). c Áiríodh na hathróga seo a leanas in anailís PCA: comhartha GA, déine fáis dromchla, anisotrópacht fáis dromchla, agus léiriú CLV3. Bhí comhghaolú diúltach den chuid is mó ag comhpháirt PCA 1 le déine fáis dromchla agus comhghaolú dearfach le comhartha GA. Bhí comhghaolú dearfach den chuid is mó ag comhpháirt PCA 2 le anisotrópacht fáis dromchla agus comhghaolú diúltach le léiriú CLV3. Léiríonn na céatadáin an t-athrú a mhíníonn gach comhpháirt. d Anailís comhghaolmhaireachta Spearman idir comhartha GA, déine fáis dromchla, agus anisotrópacht fáis dromchla ag an scála fíocháin gan CZ san áireamh. Is í an uimhir ar dheis an luach Spearman rho idir dhá athróg. Léiríonn réiltíní cásanna ina bhfuil an comhghaolmhaireacht/comhghaol diúltach an-suntasach. e Amharcléiriú 3D ar chealla Col-0 SAM L1 trí mhicreascópacht chomhfhócasach. Tá cillbhallaí nua déanta sa SAM (ach ní sa primordium) ag 10 h daite de réir a luachanna uillinne. Taispeántar an barra datha sa chúinne íochtarach ar dheis. Taispeánann an inset an íomhá 3D chomhfhreagrach ag 0 h. Rinneadh an turgnamh faoi dhó le torthaí comhchosúla. f Léiríonn ceapacha boscaí rátaí rannán cille in IPR agus neamhIPR Col-0 SAM (n = 10 ngléasra neamhspleácha). Taispeánann an lárlíne an t-airmheán, agus léiríonn teorainneacha na mbosca an 25ú agus 75ú peircintíl. Léiríonn guairneáin na luachanna íosta agus uasta a chinntear le bogearraí R. Fuarthas luachanna P le t-tástáil dhá eireaball Welch. g, h Léaráid scéimreach a thaispeánann (g) conas uillinn an chillbhalla nua (magenta) a thomhas maidir leis an treo gathach ó lár an SAM (líne poncaithe bhán) (ní bhreithnítear ach luachanna géaruillinne, .i., 0–90°), agus (h) na treoracha imlíneacha/cliathánacha agus gathacha laistigh den mhíréistéam. i Histeagraim minicíochta de threoshuíomh plána deighilte cille trasna an SAM (gorm dorcha), IPR (meánach gorm), agus neamh-IPR (gorm éadrom), faoi seach. Fuarthas luachanna P trí thástáil Kolmogorov-Smirnov dhá eireaball. Rinneadh an turgnamh faoi dhó le torthaí comhchosúla. j Histeagraim minicíochta de threoshuíomh eitleáin rannán cille an IPR timpeall P3 (glas éadrom), P4 (glas meánach), agus P5 (glas dorcha), faoi seach. Fuarthas luachanna P trí thástáil Kolmogorov-Smirnov dhá eireaball. Rinneadh an turgnamh faoi dhó le torthaí comhchosúla.
Dá bhrí sin, rinneamar imscrúdú ar an gcomhghaol idir comharthaíocht GA agus gníomhaíocht rannán cille trí bhallaí cille nua-chruthaithe a aithint le linn na measúnachta ( Fíor. 5e). Thug an cur chuige seo deis dúinn minicíocht agus treo na rannóige cille a thomhas. Ar ionadh, fuair muid amach go raibh minicíocht na rannáin cille san IPR agus an chuid eile den SAM (neamh-IPR, Fíor 5f) cosúil leis, rud a léiríonn nach ndéanann difríochtaí i gcomharthaí GA idir cealla IPR agus neamh-IPR difear suntasach do rannán cille. Spreag sé seo, agus an comhghaol dearfach idir comharthaíocht GA agus aniseatrópacht fáis, dúinn machnamh a dhéanamh an bhféadfadh gníomhaíocht comharthaíochta GA tionchar a imirt ar threoshuíomh an eitleáin rannán cille. Thomhaiseamar treoshuíomh an bhalla cille nua mar ghéaruillinn i gcoibhneas leis an ais gathacha a cheanglaíonn an t-ionad míristéamach agus lár an bhalla cille nua (Fíor 5e-i) agus thugamar faoi deara go raibh claonadh soiléir ag cealla roinnt ag uillinneacha gar do 90 ° i gcoibhneas leis an ais gathacha, leis na minicíochtaí is airde faoi deara ag 70-80 ° (23.28%) (23.28%). 5e,i), a fhreagraíonn do rannáin cille sa treo imlíneach/trasnach (Fíor 5h). Chun scrúdú a dhéanamh ar an méid a chuireann comharthaíocht GA leis an iompar rannán cille seo, rinneamar anailís ar pharaiméadair rannáin cille san IPR agus neamh-IPR ar leithligh (Fíor 5i). Thugamar faoi deara go raibh difríocht idir an dáileadh uillinn roinnte i gcealla IPR agus an dáileadh i gcealla neamh-IPR nó i gcealla sa SAM ar fad, agus léirigh cealla IPR cion níos airde de rannáin cille cliathánach / ciorclach, ie, 70-80 ° agus 80-90 ° (33.86% agus 30.71%, faoi seach, comhréireanna comhfhreagracha) (Fíor 5i). Mar sin, léirigh ár gcuid tuairimí comhlachas idir comharthaíocht GA ard agus treoshuíomh eitleáin rannán cille gar don treo imlíne, cosúil leis an gcomhghaol idir gníomhaíocht comharthaíochta GA agus aniseatrópacht fáis (Fíor 5c, d). Chun caomhnú spáis an chomhlachais seo a bhunú a thuilleadh, thomhaiseamar treoshuíomh an eitleáin rannáin i gcealla IPR timpeall ar an primordium ag tosú ó P3, ós rud é gur aimsíodh an ghníomhaíocht comharthaíochta GA is airde sa réigiún seo ag tosú ó P4 (Fíor 4). Níor léirigh uillinneacha rannáin an IPR timpeall P3 agus P4 aon difríochtaí suntasacha staitistiúla, cé gur breathnaíodh minicíocht mhéadaithe de rannáin cille cliathánach san IPR timpeall P4 (Fíor 5j). Mar sin féin, sna cealla IPR timpeall P5, tháinig an difríocht i dtreoshuíomh an eitleáin rannáin cille suntasach go staitistiúil, le méadú géar ar mhinicíocht na rannán cille trasnánach (Fíor 5j). Le chéile, tugann na torthaí seo le tuiscint gur féidir le comharthaíocht GA treoshuíomh rannán cille sa SAM a rialú, atá ag teacht le tuarascálacha roimhe seo40,41 gur féidir le comharthaíocht ard GA treoshuíomh cliathánach na rannán cille san IPR a chothú.
Tá sé tuartha nach ndéanfar cealla san IPR a ionchorprú i primordia ach in internodes2,42,43. D’fhéadfadh go n-eagrófaí sraitheanna fadaimseartha comhthreomhara de chealla eipideirm in internodes mar thoradh ar threoshuíomh trasna rannán cille san IPR. Tugann ár dtuairimí a gcuirtear síos orthu thuas le fios gur dócha go mbeidh ról ag comharthaíocht GA sa phróiseas seo trí threo na rannóige cille a rialú.
Mar thoradh ar chailliúint fheidhm roinnt géinte DELLA bíonn freagra GA comhdhéanach ann, agus is féidir della mutants a úsáid chun an hipitéis seo a thástáil44. Rinneamar anailís ar dtús ar phatrúin slonn cúig ghéinte DELLA sa SAM. Léirigh comhleá tras-scríofa den líne GUS45 go raibh GAI, RGA, RGL1, agus RGL2 (go pointe i bhfad níos lú) in iúl sa SAM (Fíor Forlíontach 11a-d). Léirigh hibridiú in situ tuilleadh go gcruinníonn GAI mRNA go sonrach i primordia agus bláthanna a fhorbairt (Fíor Forlíontach 11e). Braitheadh RGL1 agus RGL3 mRNA ar fud an ceannbhrat SAM agus i bláthanna níos sine, ach bhí RGL2 mRNA níos flúirseach i réigiún na teorann (Fíor Forlíontach. 11f-h). Íomháú comhfhócasach de pRGL3::RGL3-GFP SAM dheimhnigh an slonn a breathnaíodh ag hibridiú in situ agus léirigh sé go carnann próitéin RGL3 sa chuid lárnach den SAM (Fíor Forlíontach 11i). Ag baint úsáide as an líne pRGA::GFP-RGA, fuaireamar amach freisin go carnann próitéin RGA sa SAM, ach laghdaíonn a flúirse ag an teorainn ag tosú ó P4 (Fíor Forlíontach 11j). Go háirithe, tá patrúin slonn RGL3 agus RGA comhsheasmhach le gníomhaíocht comharthaíochta GA níos airde san IPR, mar a aimsítear ag qmRGA (Fíor 4). Ina theannta sin, tugann na sonraí seo le fios go gcuirtear na DELLA ar fad in iúl sa SAM agus go gcuimsíonn a slonn le chéile trasna an SAM ar fad.
Rinneamar anailís ina dhiaidh sin ar na paraiméadair rannán cille sna mutants fiáin-cineál SAM (Ler, control) agus an gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (domhanda) mutants (Fíor 6a, b). Suimiúil go leor, thugamar faoi deara athrú suntasach go staitistiúil i ndáileadh na minicíochtaí uillinne rannán cille sa della domhanda mutant SAM i gcomparáid leis an gcineál fiáin ( Fíor. 6c ). Tharla an t-athrú seo ar an tsóiteáin dhomhanda della mar gheall ar mhéadú ar mhinicíocht uillinneacha 80-90 ° (34.71% vs. 24.55%) agus, go pointe níos lú, uillinneacha 70-80 ° (23.78% vs 20.18%), ie, a fhreagraíonn do rannáin thrasnacha cille (Fig. 6c). An minicíocht neamh-ranna trasnacha (0-60 °) a bhí níos ísle freisin sa mutant domhanda della ( Fíor. 6c ). Méadaíodh minicíocht na rannán cille trasna go suntasach i SAM an tsóiteáin dhomhanda della (Fíor 6b). Bhí minicíocht na rannán cille trasnánach san IPR níos airde freisin sa della mutant domhanda i gcomparáid leis an gcineál fiáin (Fíor 6d). Lasmuigh den réigiún IPR, bhí dáileadh níos comhionainne ag an gcineál fiáin d’uillinneacha rannán cille, ach b’fhearr leis an tsóiteán domhanda della rannáin tadhlaíocha cosúil leis an IPR (Fíor 6e). Rinneamar cainníochtú freisin ar threoshuíomh na rannán cille i SAM de chuid mutants cúigearacha ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, agus ga2ox6-2), cúlra mutant GA-neamhghníomhach ina charnann GA. Ag teacht leis an méadú ar leibhéil GA, bhí an SAM den inflorescence mutant quintuple ga2ox níos mó ná Col-0 (Fíor Fhorlíontach 12a, b), agus i gcomparáid le Col-0, léirigh an quintuple ga2ox SAM dáileadh difriúil ar leith d'uillinneacha rannán cille, agus mhéadaigh minicíocht na huillinne ó 50 ° go 90 ° i bhfabhar rannán ential (roinnt fabhrach). 12a–c). Mar sin, léirímid go n-eascraíonn gníomhachtú comhdhéanta comharthaí GA agus carnadh GA deighiltí cille cliathánach san IPR agus sa chuid eile den SAM.
a, b Amharcléiriú 3D ar an gciseal L1 de Ler (a) le daite PI agus domhanda della mutant (b) SAM ag baint úsáide as micreascópacht chomhfhócasach. Taispeántar cillbhallaí nua a foirmíodh sa SAM (ach ní sa primordium) thar thréimhse 10 n-u agus dathaítear iad de réir a luachanna uillinne. Taispeánann an inset an SAM ag 0 h. Taispeántar an barra datha sa chúinne íochtarach ar dheis. Léiríonn an tsaighead i (b) sampla de chomhaid cille ailínithe sa domhanda della mutant. Rinneadh an turgnamh faoi dhó le torthaí comhchosúla. ce comparáid a dhéanamh idir dáileadh minicíochta treoshuímh eitleáin rannán cille sa SAM (d), IPR (e), agus neamh-IPR (f) idir Ler agus global della. Fuarthas luachanna P ag baint úsáide as tástáil Kolmogorov-Smirnov dhá eireaball. f, g Amharcléiriú 3D ar íomhánna comhfhócasacha de SAM dhaite PI de Col-0 (i) agus pCUC2::gai-1-VENUS (j) plandaí trasgenacha. Taispeánann painéil (a, b) cillbhallaí nua (ach ní primordia) a foirmíodh sa SAM laistigh de 10 h. Rinneadh an turgnamh faoi dhó le torthaí comhchosúla. h–j Comparáid a dhéanamh ar dháileadh minicíochta treoshuímh plána deighilte cille atá suite sa SAM (h), IPR (i) agus neamh-IPR (j) ar fad idir gléasraí Col-0 agus pCUC2::gai-1-Véineas. Fuarthas luachanna P trí úsáid a bhaint as tástáil dhá earball Kolmogorov–Smirnov.
Ansin rinneamar tástáil ar an éifeacht a bhaineann le comharthaíocht GA a chosc go sonrach san IPR. Chuige sin, d’úsáideamar an tionscnóir cupán cotyledon 2 (CUC2) chun léiriú a dhéanamh ar phróitéin ceannasach diúltach gai-1 atá comhleádh le Véineas (sa líne pCUC2::gai-1-VENUS). I SAM de chineál fiáin, cuireann an tionscnóir CUC2 an chuid is mó de IPRanna sa SAM chun cinn, lena n-áirítear cealla teorann, ó P4 ar aghaidh, agus breathnaíodh sainléiriú comhchosúil i pCUC2:: plandaí gai-1-VENUS (féach thíos). Ní raibh difríocht shuntasach idir dáileadh na n-uillinneacha rannán cille trasna SAM nó IPR pCUC2::gai-1-Véineas plandaí agus an cineál fiáin, cé go bhfuaireamar amach gan choinne go raibh cealla gan IPR sna plandaí seo roinnte ag minicíocht níos airde 80-90 ° (Fíor 6f-j).
Tá sé tugtha le fios go mbraitheann treo deighilt na gceall ar chéimseata an SAM, go háirithe an strus teanntachta a ghineann cuar an fhíocháin46. D’fhiafraigh muid dá bhrí sin ar athraíodh cruth an SAM sna plandaí della mutant global agus pCUC2::gai-1-VENUS. Mar a tuairiscíodh roimhe seo12, bhí méid an della domhanda mutant SAM níos mó ná an cineál fiáin (Fíor Forlíontach 13a, b, d). Dheimhnigh hibridiú in situ de CLV3 agus STM RNA an leathnú meristem i della mutants agus léirigh sé tuilleadh leathnú cliathánach nideoige na gascheall (Fíor Forlíontach 13e, f, h, i). Mar sin féin, bhí an cuaire SAM comhchosúil sa dá ghéinitíopa (Fíor Forlíontach 13k, m, n, p). Thugamar faoi deara méadú den chineál céanna i méid sa mutant quadruple gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della gan athrú cuaire i gcomparáid leis an gcineál fiáin (Fíor Forlíontach 13c, d, g, j, l, o, p). Bhí tionchar freisin ag minicíocht treoshuíomh rannán cille sa mutant quadruple della, ach go pointe níos lú ná sa tsóiteáin della monolithic (Fíor Forlíontach. 12d-f). Tugann an éifeacht dáileog seo, in éineacht leis an easpa éifeacht ar chuar, le fios go gcuireann gníomhaíocht RGL3 iarmharach i mutant quadruple Della teorainn le hathruithe ar threoshuíomh rannán cille de bharr caillteanas gníomhaíochta DELLA agus go dtarlaíonn athruithe i rannáin cliathánach cille mar fhreagra ar athruithe ar ghníomhaíocht comharthaíochta GA seachas athruithe i geoiméadracht SAM. Mar a thuairiscítear thuas, tiomáineann an tionscnóir CUC2 léiriú IPR sa SAM ag tosú ag P4 (Fíor Forlíontach 14a, b), agus i gcodarsnacht leis sin, bhí méid laghdaithe ag an pCUC2::gai-1-VENUS SAM ach cuaire níos airde (Fíor Forlíontach 14c-h). D’fhéadfadh dáileadh difriúil struis mheicniúla a bheith mar thoradh ar an athrú seo ar mhoirfeolaíocht pCUC2 ::gai-1-VENUS SAM i gcomparáid leis an gcineál fiáin, ina dtosaíonn struis imlíne ard ag achar níos giorra ó lár SAM47. De rogha air sin, d’fhéadfadh na hathruithe ar mhoirfeolaíocht pCUC2::gai-1-VENUS SAM a bheith mar thoradh ar athruithe ar airíonna meicniúla réigiúnacha de bharr slonn trasghéine48. Sa dá chás, d’fhéadfadh sé seo éifeachtaí na n-athruithe ar chomharthaíocht GA a fhritháireamh go páirteach tríd an dóchúlacht go roinnfidh cealla sa treoshuíomh imlíneach/trasnach a mhéadú, ag míniú ár gcuid tuairimí.
Le chéile, deimhníonn ár gcuid sonraí go bhfuil ról gníomhach ag comharthaíocht GA níos airde i dtreoshuíomh cliathánach an eitleáin rannán cille san IPR. Léiríonn siad freisin go mbíonn tionchar ag cuaire an mhéistéam freisin ar threoshuíomh an eitleáin rannán cille san IPR.
Tugann treoshuíomh trasnánach an eitleáin rannáin san IPR, mar gheall ar ghníomhaíocht comharthaíochta GA ard, le fios go ndéanann GA réamh-eagrú ar chomhad cille gathacha san eipideirm laistigh den SAM chun an eagraíocht cheallacha a aimseofar níos déanaí san internode epidermal a shainiú. Go deimhin, bhí comhaid cille den sórt sin le feiceáil go minic i íomhánna SAM de mutants domhanda dell (Fig. 6b). Mar sin, chun tuilleadh iniúchta a dhéanamh ar fheidhm fhorbartha phatrún spásúlachta na comharthaíochta GA sa SAM, d’úsáideamar íomháú imeacht ama chun anailís a dhéanamh ar eagrú spásúlachta na gceall san IPR i gcineál fiáin (Ler agus Col-0), della mutants domhanda, agus pCUC2::gai-1-Véineas plandaí trasgenacha.
Fuaireamar amach gur léirigh qmRGA gur mhéadaigh gníomhaíocht comharthaíochta GA san IPR ó P1/P2 agus go raibh buaicphointe ag P4, agus d’fhan an patrún seo seasmhach le himeacht ama (Fíor 4a–f agus Fíor Forlíontach 8c–f, k). Chun anailís a dhéanamh ar eagrú spásúil na gceall san IPR le comhartha GA ag méadú, rinneamar cealla Ler IPR a lipéadú thuas agus ar thaobh P4 de réir a gcinniúint forbartha a ndearnadh anailís orthu 34 h tar éis an chéad bhreathnaithe, ie, níos mó ná dhá uair plastid, rud a ligeann dúinn cealla IPR a leanúint le linn forbairt primordium ó P1 / P2 go P4. D'úsáideamar trí dhath dhifriúla: buí do na cealla sin a comhtháthaíodh isteach sa primordium in aice le P4, glas dóibh siúd a bhí san IPR, agus corcra dóibh siúd a ghlac páirt sa dá phróiseas (Fíor 7a-c). Ag t0 (0 h), bhí 1-2 sraitheanna de chealla IPR le feiceáil os comhair P4 ( Fíor. 7a ). Mar a bheifí ag súil leis, nuair a roinneadh na cealla seo, rinne siad amhlaidh go príomha tríd an eitleán tras-roinne (Fíoracha 7a–c). Fuarthas torthaí cosúla ag baint úsáide as Col-0 SAM (ag díriú ar P3, a bhfuil a theorann fillte cosúil le P4 i Ler), cé gur sa ghéinitíopa seo chuir an huaire a foirmíodh ag an teorainn bláthanna na cealla IPR i bhfolach níos tapúla (Fíor 7g-i). Mar sin, réamh-eagraíonn patrún roinnte na gceall IPR na cealla ina sraitheanna gathacha, mar atá in internodes. Tugann eagrú na sraitheanna gathacha agus logánú na gceall IPR idir orgáin leantacha le fios gur sleachta internodal iad na cealla seo.
Anseo, d'fhorbraíomar bithbhraiteoir comharthaíochta GA cóimheasmhéadrach, qmRGA, a cheadaíonn mapáil chainníochtúil ar ghníomhaíocht comharthaíochta GA a eascraíonn as comhchruinnithe gabhdóirí GA agus GA agus ag an am céanna cur isteach ar bhealaí comharthaíochta ingineacha a íoslaghdú, rud a sholáthraíonn faisnéis ar fheidhm GA ag an leibhéal ceallacha. Chuige sin, thógamar próitéin DELLA mionathraithe, mRGA, a chaill an cumas comhpháirtithe idirghníomhaíochta DELLA a cheangal ach a fhanann íogair do phróitéalú de bharr GA. Freagraíonn qmRGA d’athruithe exogenous agus ingenous i leibhéil GA, agus cuireann a airíonna braite dinimiciúla ar chumas measúnú a dhéanamh ar athruithe spásúlachta i ngníomhaíocht chomharthaíochta GA le linn forbartha. Is uirlis an-solúbtha é qmRGA freisin mar is féidir é a oiriúnú d’fhíocháin éagsúla tríd an tionscnóir a úsáidtear dá léiriú a athrú (más gá), agus i bhfianaise nádúr caomhnaithe an chosáin chomharthaíochta GA agus móitíf PFYRE trasna angiosperms, is dócha go mbeidh sé inaistrithe chuig speicis eile22. Ag teacht leis seo, léiríodh go gcuirfeadh sóchán coibhéiseach sa phróitéin ríse SLR1 DELLA (HYY497AAA) gníomhaíocht athbhrúite fáis SLR1 faoi chois agus gan ach laghdú beag ar a dhíghrádú trí mheán GA, cosúil le mRGA23. Go háirithe, léirigh staidéir a rinneadh le déanaí in Arabidopsis gur athraigh sóchán aimínaigéad amháin san fhearann PFYRE (S474L) gníomhaíocht trascríobh RGA gan cur isteach ar a chumas idirghníomhú le comhpháirtithe fachtóir trascríobh50. Cé go bhfuil an sóchán seo an-ghar do na 3 ionadaí aimínaigéad atá i mRGA, léiríonn ár gcuid staidéir go n-athraíonn an dá shóchán seo tréithe sainiúla DELLA. Cé go gceanglaíonn formhór na gcomhpháirtithe fachtóir trascríobh le fearainn LHR1 agus SAW de DELLA26,51, d’fhéadfadh roinnt aimínaigéid chaomhnaithe san fhearann PFYRE cuidiú leis na hidirghníomhaíochtaí seo a chobhsú.
Is príomhthréith é forbairt internode in ailtireacht plandaí agus feabhsú toraidh. Nocht qmRGA gníomhaíocht comharthaíochta GA níos airde i gcealla progenitor internode IPR. Trí íomháú cainníochtúil agus géineolaíocht a chomhcheangal, thaispeáin muid go bhforshuiteann patrúin comharthaíochta GA eitleáin rannáin chiorclacha/trasghearrtha san eipideirm SAM, ag múnlú na heagraíochta rannán cille atá ag teastáil le haghaidh forbairt idirnóid. Sainaithníodh roinnt rialtóirí maidir le treoshuíomh eitleáin rannán cille le linn na forbartha52,53. Soláthraíonn ár gcuid oibre sampla soiléir den chaoi a rialaíonn gníomhaíocht comharthaíochta GA an paraiméadar ceallacha seo. Is féidir le DELLA idirghníomhú le coimpléisc próitéine réamhfhillte41, mar sin is féidir le comharthaíocht GA treoshuíomh eitleáin rannán cille a rialáil trí thionchar díreach a imirt ar threoshuíomh micriteibile cortical40,41,54,55. Léirigh muid gan choinne, i SAM, nach raibh an comhghaol de ghníomhaíocht comharthaíochta GA níos airde fadú cille nó roinnt, ach amháin anisotrópacht fáis, atá ag teacht le héifeacht dhíreach GA ar threo na rannán cille san IPR. Mar sin féin, ní féidir linn a eisiamh go bhféadfadh an éifeacht seo a bheith indíreach freisin, mar shampla idirghabháil trí mhaolú balla cille spreagtha ag GA56. Cothaíonn athruithe ar airíonna balla cille strus meicniúil57,58, a d'fhéadfadh tionchar a bheith aige freisin ar threoshuíomh an eitleáin rannán cille trí thionchar a imirt ar threoshuíomh na micritiúbúl cortical39,46,59. D’fhéadfadh go mbeadh baint ag éifeachtaí comhcheangailte strus meicniúil de bharr GA agus rialáil dhíreach ar threoshuíomh microtubule ag GA le patrún sonrach treoshuíomh rannán cille a ghiniúint san IPR chun internodes a shainiú, agus tá gá le tuilleadh staidéir chun an smaoineamh seo a thástáil. Mar an gcéanna, léirigh staidéir roimhe seo an tábhacht a bhaineann leis na próitéiní idirghníomhaithe DELLA TCP14 agus 15 maidir le foirmiú internode a rialú60,61 agus d’fhéadfadh na fachtóirí seo gníomh GA a idirghabháil in éineacht le BREVIPEDICELLUS (BP) agus PENNYWISE (PNY), a rialaíonn forbairt idirnóid agus ar léiríodh go mbíonn tionchar acu ar chomharthaíocht GA2,62. Ós rud é go n-idirghníomhaíonn DELLAanna le cosáin chomharthaíochta brassinosteroid, eitiléine, aigéad jasmónach, agus aigéad abscisic (ABA)63,64 agus gur féidir leis na hormóin seo tionchar a imirt ar threoshuíomh microtubule65, féadfaidh hormóin eile éifeachtaí GA ar threoshuíomh rannán cille a idirghabháil freisin.
Léirigh staidéir chíteolaíochta luatha go bhfuil na réigiúin laistigh agus lasmuigh den SAM Arabidopsis ag teastáil le haghaidh forbairt idirnóid2,42. Tacaíonn an fhíric go ndéanann GA rannán cille sna fíocháin istigh12 a rialáil go gníomhach le défheidhm GA maidir le míristéam agus méid internode a rialáil sa SAM. Tá patrún na treo-roinnte cille rialaithe go docht freisin i bhfíochán SAM istigh, agus tá an rialachán seo riachtanach d'fhás gas52. Beidh sé suimiúil a scrúdú an bhfuil ról ag GA freisin maidir le treoshuíomh an eitleáin chillroinnte san eagraíocht inmheánach SAM, ag sioncronú sonraíocht agus forbairt internodes laistigh den SAM.
Fásadh plandaí in vitro in ithir nó meán 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) arna fhorlíonadh le 1% siúcrós agus 1% agar (Sigma) faoi choinníollacha caighdeánacha (16 h éadrom, 22 ° C), ach amháin i gcás turgnaimh hypocotyl agus fás fréamhacha inar fhás síológa ar phlátaí ingearacha faoi sholas leanúnach agus 22 ° C. Le haghaidh turgnaimh níotráite, fásadh plandaí ar mheán MS modhnaithe (meán planda bioWORLD) arna fhorlíonadh le níotráit leordhóthanach (0 nó 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% siúcrós agus 1% A-agar (Sigma) faoi choinníollacha fad-lae.
Cuireadh GID1a cDNA a cuireadh isteach i pDONR221 le chéile arís le pDONR P4-P1R-pUBQ10 agus pDONR P2R-P3-mCherry isteach i pB7m34GW chun pUBQ10::GID1a-mCherry a ghiniúint. Cuireadh DNA IDD2 a cuireadh isteach i pDONR221 le chéile arís i pB7RWG266 chun p35S: IDD2-RFP a ghiniúint. Chun pGID1b a ghiniúint:::2xmTQ2-GID1b, méadaíodh ar dtús blúire 3.9 kb in aghaidh an tsrutha ó réigiún códaithe GID1b agus blúire 4.7 kb ina raibh an GID1b cDNA (1.3 kb) agus an Críochnaitheoir (3.4 kb) trí úsáid a bhaint as na primers i dTábla Forlíontach 3 agus ansin PDNR1P4-isteach i dTábla Forlíontach 3 agus ansin PDNR1P4-isteach i dTábla Forlíontach. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), faoi seach, agus ar deireadh athchur le chéile le pDONR221 2xmTQ268 isteach sa veicteoir sprice pGreen 012567 ag baint úsáide as clónáil Gateway. Chun pCUC2 a ghiniúint::LSSmOrange, cuireadh an seicheamh tionscnóra CUC2 (3229 bp in aghaidh an tsrutha ó ATG) agus an seicheamh códaithe de mhórain mhóra aistrithe Stokes (LSSmOrange)69 ina dhiaidh sin le comhartha logánaithe núicléach an N7 agus críochnóir trascríobh NOS le chéile isteach sa pGreen kanamycining targeting system-vectorination ag baint úsáide as an gcóras inghnóthaithe in-aisghabhála kanamycin. Tugadh isteach an veicteoir dhénártha plandaí isteach sa strain Agrobacterium tumefaciens GV3101 agus tugadh isteach i duilleoga Nicotiana benthamiana trí mhodh insíothlaithe Agrobacterium agus isteach i Arabidopsis thaliana Col-0 trí mhodh snámh bláthanna, faoi seach. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry agus pCLV3::mCherry-NLS Bhí qmRGA scoite amach ó shliocht F3 agus F1 na gcros faoi seach, faoi seach.
Rinneadh hibridiú RNA in situ ar leideanna péine timpeall 1 cm ar fad72, a bailíodh agus a socraíodh láithreach i dtuaslagán FAA (3.7% formaildéad, 5% aigéad aicéiteach, 50% eatánól) réamhfhuaraithe go 4 °C. Tar éis cóireálacha folúis 2 × 15 nóiméad, athraíodh an fostóir agus goradh samplaí thar oíche. Rinneadh sintéisiú ar cDNAs GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, agus RGL3 agus tóireadóirí antisense dá 3′-UTR ag baint úsáide as na primers a thaispeántar i dTábla Forlíontach 3 mar a thuairiscítear ag Rosier et al.73. Braitheadh tóireadóirí lipéadaithe digoxigenin trí úsáid a bhaint as antasubstaintí digoxigenin (caolú 3000-huaire; Roche, uimhir chatalóige: 11 093 274 910), agus rinneadh na codanna a dhathú le fosfáit 5-bróma-4-chloro-3-indolyl (BCIP, caolú 250-huaire), / BTtrozni 250-huaire tetrazni, caolú 250-huaire; caolú) tuaslagán.
Am poist: Feabhra-10-2025