Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tacaíocht teoranta CSS ag an leagan den bhrabhsálaí atá in úsáid agat.Chun na torthaí is fearr a fháil, molaimid duit leagan níos nuaí de do bhrabhsálaí a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, táimid ag taispeáint an tsuímh gan stíliú nó JavaScript.
Is féidir le fionnachtain agus úsáid thairbheach táirgí nádúrtha cabhrú le saol an duine a fheabhsú.Úsáidtear ceimiceáin coisctheacha fás plandaí go forleathan mar luibhicídí chun fiailí a rialú.Mar gheall ar an ngá atá le cineálacha éagsúla luibhicídí a úsáid, tá gá le comhdhúile a aithint le meicníochtaí nua gníomhaíochta.Sa staidéar seo, fuair muid amach cumaisc N -alkoxypyrrole úrscéal, coumamonamide, ó Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus bhunaigh sé an próiseas sintéise iomlán.Trí thástálacha ar ghníomhaíocht bhitheolaíoch, fuaireamar amach gur idirmheánach sintéiseach urs-monaimíd é aigéad urs-monamach agus poitéinsealinhibitor fás plandaí.Ina theannta sin, tá díorthaigh aigéad urbenonic éagsúla forbartha againn, lena n-áirítear an díorthach urbenyloxy (UDA), a bhfuil gníomhaíocht luibhicídeach ard gan tionchar diúltach ar fhás cealla HeLa.Fuaireamar amach freisin go gcuireann díorthaigh aigéid urmotonic isteach ar mhicritiúibíní plandaí;ina theannta sin, cuireann KAND isteach ar fhiliméid actin agus cuireann sé bás cille i bhfeidhm;Tá difríocht idir na héifeachtaí ilghnéitheacha seo agus iad siúd a bhaineann le coscairí micriteibile aitheanta agus moltar meicníocht nua gníomhaíochta d'aigéad ursonach, rud a léiríonn buntáiste tábhachtach i bhforbairt luibhicídí nua.
Is bealach é fionnachtain agus cur i bhfeidhm praiticiúil táirgí nádúrtha tairbhiúla agus a gcuid díorthach chun cáilíocht shaol an duine a fheabhsú.Tá dul chun cinn mór sa leigheas agus sa talmhaíocht mar thoradh ar mheitibilítí tánaisteacha arna dtáirgeadh ag miocrorgánaigh, plandaí agus feithidí.Forbraíodh go leor antaibheathaigh agus drugaí frith-leoicéime ó tháirgí nádúrtha.Ina theannta sin, cineálacha éagsúla delotnaidicídí, baintear múiscnimheanna agus luibhicídí as na táirgí nádúrtha seo lena n-úsáid sa talmhaíocht.Go háirithe, is uirlisí tábhachtacha iad luibhicídí rialaithe fiailí chun táirgeacht na mbarr a mhéadú sa talmhaíocht nua-aimseartha, agus úsáidtear cineálacha éagsúla comhdhúile ar bhonn tráchtála cheana féin.Meastar gur gnáth-spriocanna luibhicídí iad roinnt próisis cheallacha i bplandaí, mar shampla fótaisintéis, meitibileacht aimínaigéad, sintéis balla cille, rialú miotóis, comharthaíocht fítea-hormóin, nó sintéis próitéine.Is aicme choitianta luibhicídí iad comhdhúile a chuireann bac ar fheidhm na micriteibile a chuireann isteach ar fhás plandaí trí chur i bhfeidhm ar rialáil miotóiseach2.
Comhpháirteanna den chite-chnámharlach is ea na micritiúibíní agus caomhnaítear go forleathan iad i gcealla eucaryotic.Is éard atá sa heterodimer tubulin ná α-tubulin agus β-tubulin a fhoirmíonn próifiolaimíní microtubule líneach, le 13 protofilament ina struchtúr sorcóireach.Imríonn microtubules róil iolracha i gcealla plandaí, lena n-áirítear cruth cille, rannán cille, agus iompar incheallach a chinneadh3,4.Tá microtubules i gcealla planda faoin scannán idirphase plasma, agus meastar go rialaíonn na micreathibíní cortical seo, mar a thugtar orthu, eagrú micreafhibril ceallalóis trí choimpléisc sintéise ceallalóis4,5 a rialáil.Tá microtubules cortical de chealla eipideirmeacha fréamhacha, atá i láthair sa chrios fadaithe tapa ar an mbarr fréimhe, suite go cliathánach, agus leanann microfibers ceallalóis na microtubules seo agus cuireann siad teorainn le treo leathnú cille, rud a chuireann fadú cille anisotrópach chun cinn.Dá bhrí sin, tá dlúthbhaint ag feidhm microtubule le moirfeolaíocht plandaí.Tá ionaid aimínaigéad i ngéinte a ionchódaíonn tubulin ina chúis le sceabhadh ar eagair mhiocróbúl cortical agus fás ar an taobh clé nó ar an taobh dheis in Arabidopsis 6,7.Ar an gcaoi chéanna, is féidir fás fréamhacha a shaobhadh8,9,10,11,12,13, a shaobhadh mar thoradh ar shócháin i bpróitéiní a bhaineann le micreictiúbán a rialaíonn dinimic na micriteibile.Ina theannta sin, má dhéantar cóireáil le luibhicídí a chuireann isteach ar mhicritiúibín, amhail dé-óipirimíd, ar a dtugtar pretilachlor freisin, is cúis le fás fiarfhréamhacha ar an taobh clé14.Tugann na sonraí seo le fios go bhfuil sé ríthábhachtach feidhm na micritiúbúl a rialú go beacht chun treo fáis plandaí a chinneadh.
Thángthas ar chineálacha éagsúla coscairí microtubule, agus chuir na drugaí seo go mór le taighde cíte-chnámharlaigh, chomh maith le talmhaíocht agus leigheas2.Go háirithe, is féidir le oryzalin, comhdhúile dinitroaniline, disopyramide, comhdhúile a bhaineann le beinsamaimíd, agus a n-analógacha bac a chur ar fheidhm microtiubile agus ar an gcaoi sin bac a chur ar fhás plandaí.Dá bhrí sin, úsáidtear iad go forleathan mar luibhicídí.Mar sin féin, ós rud é gur comhpháirt thábhachtach de chealla plandaí agus ainmhithe iad microtubules, tá an chuid is mó de choscóirí microtubules citotocsaineach don dá chineál cille.Dá bhrí sin, in ainneoin a bhfóntas aitheanta mar luibhicídí, úsáidtear líon teoranta oibreán frithmhiocróbach chun críocha praiticiúla.
Is géineas den teaghlach Streptomyces é Streptomyces, a chuimsíonn baictéir aeróbach, gram-dhearfach, filamentous agus is eol go forleathan é as a chumas raon leathan meitibilítí tánaisteacha a tháirgeadh.Dá bhrí sin, meastar gurb é ceann de na foinsí is tábhachtaí de tháirgí nádúrtha nua atá gníomhach ó thaobh na bitheolaíochta.Sa staidéar reatha, fuair muid amach cumaisc nua ar a dtugtar coumamonamide, a bhí scoite ó Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus S. werraensis ISP 5486. Ag baint úsáide as anailís speictreach agus anailís speictreach iomlán, tréithríodh struchtúr coumamonamide agus a chnámharlach N-alkoxypyrrole uathúil. cinneadh.sintéis.Fuarthas amach go gcuireann aigéad Ursmonic, idirmheánach sintéiseach d'ursmonoamide agus a díorthaigh, bac ar fhás agus ar phéacadh an phlanda samhail Arabidopsis thaliana a bhfuil tóir air.I staidéar caidrimh struchtúr-ghníomhaíochta, fuaireamar amach go gcuireann cumaisc le C9 arna mhodhnú go haigéad ursonic, ar a dtugtar díorthach nonyloxy d'aigéad ursonic (KAND), go mór leis an éifeacht coisctheach ar fhás agus ar phéacadh.Go háirithe, chuir an coscóir fáis plandaí nua-aimsithe isteach ar fhás tobac agus lus an ae freisin agus ní raibh sé citotocsaineach do bhaictéir nó cealla HeLa.Ina theannta sin, cothaíonn roinnt díorthaigh aigéid urmotonic feinitíopa fréimhe saobhadh, rud a thugann le tuiscint go mbíonn tionchar díreach nó indíreach ag na díorthaigh seo ar mhicritiúbúl.Ag teacht leis an smaoineamh seo, léiríonn ár dtuairimí ar mhicritiúbúl atá lipéadaithe go himdhíon-histochemical nó le próitéiní fluaraiseacha go ndéanann cóireáil KAND dí-pholaiméiriú ar mhicritiúibíní.Ina theannta sin, chuir cóireáil le díorthaigh aigéad kumamotonic isteach ar mhicreafilamentí actin.Mar sin, tá coscaire fáis plandaí nua aimsithe againn a mbaineann meicníocht uathúil gníomhaíochta leis an gcíteischnámharlach a scriosadh.
Scaipeadh brú MK493-CF1 ón ithir i Shinagawa-ku, Tóiceo.Strain MK493-CF1 déanta pór stromal dea-brainseach.Socraíodh seicheamh páirteach na géine RNA ribosómach 16S (1422 bp).Tá an brú seo an-chosúil le S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: brú tipiciúil, 99.93%).Bunaithe ar an toradh seo, socraíodh go raibh dlúthbhaint idir an brú seo agus an cineál strain S. werraensis.Mar sin, d'ainmnigh muid an brú seo go sealadach S. werraensis MK493-CF1.Táirgeann S. werraensis ISP 5486T na comhdhúile bithghníomhacha céanna freisin.Ós rud é gur beag taighde luath a rinneadh ar tháirgí nádúrtha a fháil ón miocrorgánach seo, rinneadh tuilleadh taighde ceimiceach.Tar éis S. werraensis MK493-CF1 a shaothrú ar mheán eorna trí choipeadh soladstaide ag 30°C ar feadh 14 lá, baineadh an meán le 50% EtOH.Triomaíodh 60 ml den sampla chun 59.5 mg de amhshliocht a fháil.Cuireadh an sliocht amh faoi réir HPLC céim droim ar ais chun N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, ainmnithe coumamonamide, 36.0 mg) a thabhairt.Is é an méid iomlán de 1 ná thart ar 60% den sliocht amh.Mar sin, shocraigh muid staidéar mionsonraithe a dhéanamh ar airíonna kumamotoamide 1.
Is púdar bán éagruthach é Coumamonamide 1 agus deimhníonn mais-speictriméadracht ardtaifigh (HRESIMS) C6H8N2O2 (Fíor 1).Tá an blúire pirróil C2-ionadach den chomhdhúil seo tréithrithe ag δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH i speictream 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) agus δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), agus léiríonn an speictream 13C NMR láithreacht ceithre adamh carbóin sp2.Rinneadh measúnú ar láithreacht grúpa aimíde ag suíomh C2 ag comhghaol HMBC ón bprótón C-3 go dtí an carbón aimíd charbóin ag δC 161.1.Ina theannta sin, léiríonn buaiceanna 1 H agus 13 C NMR ag δH 4.10 (3H, S) agus δC 68.3 láithreacht grúpaí N-methocsa sa mhóilín.Cé nach raibh suíomh ceart an ghrúpa methoxy cinntithe fós ag baint úsáide as anailís speictreascópach ar nós speictreascópacht difríochta feabhsaithe agus giorrúchán Overhauser núicléach (NOEDF), tháinig N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide mar an chéad iarrthóir cumaisc.
Chun struchtúr ceart 1 a chinneadh, rinneadh sintéis iomlán (Fíor 2a).Mar thoradh ar chóireáil 2-aimínipiridín 2 atá ar fáil ar bhonn tráchtála le m-CPBA bhí an N-ocsaíd 3 comhfhreagrach sa táirgeacht chainníochtúil.Tar éis an 2 aimínaigéadú de 2, rinneadh an t-imoibriú ciocl-chomhdhlúthaithe a ndearna Abramovich cur síos air i beinséin ag 90 ° C chun an 1-hiodrocsa-1H-pirróil-2-carbónáit 5 a fháil i ngraim.Luas 60% (dhá chéim).15,16.Ansin thug meitiliú agus hidrealú 4 aigéad 1-methocsa-1H-pirróil-2-carbocsaileacha (ar a dtugtar “aigéad cumotónach”, 6) toradh maith (70%, dhá chéim).Mar fhocal scoir, trí amóinia uiscí a úsáid trí mheán clóiríd aigéad 6, thug Kumamoto aimíd 1 táirgeacht 98%.Bhí na sonraí speictreach go léir de shintéisiú 1 cosúil le scoite 1, mar sin socraíodh struchtúr 1;
Sintéis ghinearálta agus anailís ar ghníomhaíocht bhitheolaíoch urbenamide agus aigéad urbenic.(a) Sintéis iomlán Kumamoto amide.(b) Fásadh síológa de chineál fiáin Arabidopsis Columbia (Col) seacht lá d’aois ar phlátaí Murashige agus Skoog (MS) ina raibh coumamonamide 6 nó coumamonamide 1 ag na tiúchain a luaitear.Barra scála = 1 cm.
Ar dtús, rinneamar measúnú ar ghníomhaíochtaí bitheolaíocha urbenamide agus a idirmheánacha maidir lena gcumas fás plandaí a mhodhnú.Chuireamar tiúchan éagsúla ursmonamide 1 nó aigéad ursmonic 6 le síológa MS agar mheán agus saothraithe Arabidopsis thaliana ar an meán seo.Léirigh na measúnachtaí seo go raibh tiúchan arda (500 μM) de 6 bac ar fhás fréimhe (Fíor 2b).Ansin, ghineamar díorthaigh éagsúla tríd an suíomh N1 de 6 a chur in ionad agus rinneamar staidéir ar chaidreamh struchtúr-gníomhaíochta orthu (cuirtear síos ar an bpróiseas sintéise analógach san Fhaisnéis Tacaíochta (IR)).Fásadh síológa Arabidopsis ar mheán ina raibh 50 μM díorthaigh aigéad ursonic, agus rinneadh fad fréimhe a thomhas.mar a léirítear sa phictiúr.Mar a thaispeántar i bhFíoracha 3a, b, agus S1, tá faid éagsúla ag aigéid coumamo de shlabhraí alcocsa líneacha (9, 10, 11, 12, agus 13) nó slabhraí móra alcosa (15, 16, agus 17) ag suíomh N1.Léirigh na díorthaigh cosc suntasach ar fhás fréamhacha.Ina theannta sin, fuaireamar amach gur chuir cur i bhfeidhm 200 μM 10, 11, nó 17 bac ar phéacadh (Fíoracha 3c agus S2).
Staidéar ar an ngaol struchtúr-ghníomhaíocht aimíd Kumamoto agus comhdhúile gaolmhara.(a) Struchtúr agus scéim shintéise na n-analóg.(b) Cainníochtú fad fréimhe síológa 7 lá d'aois a fhástar ar mheán MS le díorthaigh chúmamonamide 50 μM nó gan iad.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha le cóireáil sham (t test, lch< 0.05).n>18. Taispeántar sonraí mar mheán ± SD.nt ciallaíonn “gan tástáil” toisc nár phéacann níos mó ná 50% de na síolta.(c) Cainníochtú ráta péactha síolta cóireáilte arna gor ar feadh 7 lá i MS mheán le nó gan 200 μM cúamonaimíd agus comhdhúile gaolmhara.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha le cóireáil sham (tástáil chi-cearnach).n=96.
Is díol spéise é gur laghdaigh slabhraí taobh ailcile níos faide ná C9 an ghníomhaíocht choisctheach, rud a thugann le tuiscint go dteastaíonn slabhraí taobh de mhéid áirithe ó chomhdhúile a bhaineann le haigéad kumamotoic chun a ngníomhaíocht bhitheolaíoch a thaispeáint.
Toisc gur léirigh anailís ar chaidrimh struchtúr-gníomhaíochta gur athraíodh C9 go haigéad ursonach agus gurbh é an díorthach nonyloxy d'aigéad ursonach (dá ngairfear KAND 11 anseo feasta) an t-inhibitor fáis plandaí is éifeachtaí, rinneamar tréithriú níos mionsonraithe ar KAND 11. Cóireáil Arabidopsis agus chuir 50 μM KAND 11 cosc beagnach go hiomlán ar phéacadh, ach chuir tiúchan níos ísle (40, 30, 20, nó 10 μM) de KAND 11 bac ar fhás fréamhacha ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 4a, b).Chun a thástáil an bhfuil tionchar ag KAND 11 ar inmharthanacht na fréimhe míristéa, scrúdaíomar míristéamaí fréimhe a bhí daite le iaidíd próipidiam (PI) agus tomhas an limistéir mhéiristeam.Ba é 151.1 ± 32.5 μm méid míristéam na síológa a fhástar ar mheán ina raibh 25 μM KAND-11, agus ba é 264.7 ± 30.8 μm (Fig d) meristem na síológa a fhástar ar mheán rialaithe ina raibh DMSO. , rud a thugann le fios go ndéanann KAND-11 gníomhaíocht cheallacha a athbhunú.ag scaipeadh.Míristeam fréimhe.Ag teacht leis seo, laghdaigh cóireáil KAND 11 an méid marcóir rannán cille CDKB2; 1p ::CDKB2; comhartha 1-GUS sa fhréamh-mhíristem (Fíor 4e) 17 .Léiríonn na torthaí seo go gcuireann KAND 11 bac ar fhás fréamhacha trí ghníomhaíocht iomadú cille a laghdú.
Anailís ar éifeacht coisctheach díorthaigh aigéad urbenónach (díorthaigh urbenyloxy) ar fhás.(a) Síológa col fiáin 7 lá d'aois a fhástar ar phlátaí MS a bhfuil na tiúchain léirithe de KAND 11 acu. Barra scála = 1 cm.(b) Cainníochtú fad na fréimhe.Léiríonn litreacha difríochtaí suntasacha (tástáil Tukey HSD, lch< 0.05).n>16. Taispeántar sonraí mar mheán ± SD.(c) Micreascópacht chomhfhócasach ar fhréamhacha fiáine de chineál dhaite iaidíde propidium a fhástar ar phlátaí MS a bhfuil 25 μM KAND acu nó nach bhfuil 11. Léiríonn lúibíní bána an fhréamh-mhíristem.Barra scála = 100 µm.(d) Cainníochtú méid na fréimhe míristéama (n = 10 go 11).Cinneadh difríochtaí staitistiúla trí úsáid a bhaint as t-thástáil (lch< 0.05).Is ionann na barraí agus meánmhéid an mhéistéam.(e) Micreascópacht chodarsnachta trasnaíochta difreálach (DIC) ar fhréamhmhíristem ina bhfuil an tógáil CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS dhaite agus dhaite ar síológa 5 lá d'aois a fhástar ar phlátaí MS le measúnacht 25 µM KAND nó gan é.
Rinneadh tástáil bhreise ar fíteatocsaineacht KAND 11 agus úsáid á baint as planda décotyledonous eile, tobac (Nicotiana tabacum), agus mór-orgánach samhail planda talún, lus an ae (Marchantia polymorpha).Mar a tharla i gcás Arabidopsis, tháirg síológa tobac SR-1 a fhástar ar mheán ina bhfuil 25 μM KAND 11 fréamhacha níos giorra (Fíor 5a).Ina theannta sin, phéacann 40 de 48 síolta ar phlátaí a raibh 200 μM KAND 11 iontu, agus phéacadh na 48 síolta ar fad ar mheáin bhréagchóireáilte, rud a thugann le fios go raibh tiúchan níos airde KAND suntasach (lch.< 0.05;chi test -square) cosc ar phéacadh tobac.(Fíor 5b).Ina theannta sin, bhí an tiúchan de KAND 11 a chuir bac ar fhás baictéarach i lus an ae cosúil leis an tiúchan éifeachtach in Arabidopsis (Fíor 5c).Léiríonn na torthaí seo gur féidir le KAND 11 bac a chur ar fhás plandaí éagsúla.Rinneamar imscrúdú ansin ar chiteatocsaineacht chomhdhúile a bhaineann le monaimíd iompróidh in orgánaigh eile, eadhon cealla HeLa daonna agus brú Escherichia coli DH5α, mar ionadaithe cealla ainmhithe agus baictéarach níos airde, faoi seach.I sraith de thástálacha ar iomadú cille, thugamar faoi deara nach raibh tionchar ag coumamonamide 1, aigéad coumamonamidic 6, agus KAND 11 ar fhás cealla HeLa nó E. coli ag tiúchan 100 μM (Fíor 5d,e).
Cosc ar fhás KAND 11 in orgánaigh neamh-Arabidopsis.(a) Fásadh síológa tobac de chineál fiáin SR-1 dhá sheachtain d’aois ar phlátaí MS a bhí suite go hingearach ina raibh 25 μM KAND 11. (b) Fásadh síológa tobac de chineál fiáin SR-1 dhá sheachtain d’aois ar shuíomh cothrománach. Plátaí MS ina bhfuil 200 μM KAND 11. (c) bachlóga ae de chineál Tak-1 dhá sheachtain d'aois a fhástar ar phlátaí Gamborg B5 leis na tiúchain léirithe de KAND 11. Léiríonn saigheada dearga spóir nár fhás astu laistigh den gor dhá sheachtain. tréimhse.(d) Measúnacht ar iomadú cille ar chealla HeLa.Rinneadh líon na gceall inmharthana a thomhas ag eatraimh ama socraithe ag baint úsáide as trealamh comhairimh cille 8 (Dojindo).Mar rialú, déileáladh le cealla HeLa le 5 μg/ml actinomycin D (Gníomh D), a chuireann bac ar thrascríobh RNA polymerase agus a chuireann bás cille faoi deara.Rinneadh anailísí faoi thrí.(e) Measúnacht ar iomadú ceall E. coli.Rinneadh anailís ar fhás E. coli trí OD600 a thomhas.Mar rialú, déileáladh le cealla le 50 μg/ml ampicillin (Amp), a chuireann bac ar shintéis balla cealla baictéarach.Rinneadh anailísí faoi thrí.
Chun meicníocht gníomhaíochta na cíteatocsaineachta de bharr comhdhúile a bhaineann le húirimíd a dhéanamh amach, rinneamar athanailís ar dhíorthaigh aigéad urbenic a raibh éifeachtaí coisctheacha measartha acu.mar a léirítear sa phictiúr.Mar a léirítear i bhFíoracha 2b, 6a, tháirg síológa a fhástar ar phlátaí agar ina raibh tiúchan ard (200 μM) d'aigéad urmotonic 6 fréamhacha níos giorra agus cuartha clé (θ = - 23.7 ± 6.1), ach ó na síológa a fhástar ar an meán rialaithe, an tháirg síológa fréamhacha beagnach díreacha (θ = – 3.8 ± 7.1).Is eol go bhfuil an fás fiar sainiúil seo mar thoradh ar mhífheidhm na micritiúibíní cortical14,18.Ag teacht leis an gcinneadh seo, spreag na drugaí díchobhsaithe microtubule agus oryzalin claonadh fréamhacha comhchosúla faoinár gcoinníollacha fáis (Fíor 2b, 6a).Ag an am céanna, rinneamar tástáil ar dhíorthaigh aigéid urmotonic agus roghnaigh muid roinnt acu a d'fhág, ag tiúchan áirithe, fás fréamhacha fiarmhótair.D'athraigh comhdhúile 8, 9, agus 15 treo fáis fréamhacha ag 75 μM, 50 μM, agus 40 μM, faoi seach, rud a léiríonn gur féidir leis na comhdhúile seo microtubules a dhíchobhsú go héifeachtach (Fíor 2b, 6a).Rinneamar tástáil freisin ar an díorthach aigéad ursolic is cumhachtaí, KAND 11, ag tiúchan níos ísle (15 µM) agus fuaireamar amach gur chuir cur i bhfeidhm KAND 11 bac ar fhás fréamhacha agus go raibh treo fáis na fréamhacha míchothrom, cé go raibh claonadh acu le fána ar chlé ( Fíor C3)..Toisc go gcuireann tiúchan níos airde de dhrugaí díchobhsaithe microtubules bac ar fhás plandaí uaireanta seachas a bheith ina gcúis le tilt fréimhe, rinneamar measúnú ina dhiaidh sin ar an bhféidearthacht go gcuirfeadh KAND 11 isteach ar mhicritiúibíní trí mhicritiúibíní cortical a bhreathnú i gcealla fréamhacha eipideirm.Immunohistochemistry ag baint úsáide as antasubstaintí frith-β-tubulin i gcealla epidermal fréamhacha síológ cóireáilte le 25 μM KAND 11 léirigh an cealú beagnach gach microtubules cortical i gcealla eipideirm sa chrios fadú (Fíor 6 b).Tugann na torthaí seo le fios go ngníomhaíonn aigéad kumamotonic agus a dhíorthaigh go díreach nó go hindíreach ar mhicritiúbúl chun cur isteach orthu agus gur coscóirí nua-mhicrubúl iad na comhdhúile seo.
Athraíonn aigéad ursonach agus a chuid díorthaigh microtubules cortical in Arabidopsis thaliana.(a) Uillinn claonta fréimhe arna tomhas i láthair na ndíorthach d'aigéad urmónach éagsúla ag na tiúchain a luaitear.Rinneadh anailís freisin ar éifeachtaí dhá chomhdhúil arb eol go gcuireann siad bac ar mhicritiúibíní: disopyramide agus oryzalin.Taispeánann an inset an caighdeán a úsáidtear chun uillinn fáis fréamhacha a thomhas.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha le cóireáil sham (t test, lch< 0.05).n>19. Barra scála = 1 cm.(b) Micribhithíní cortical i gcealla eipideirm sa chrios fadaithe.Rinneadh microtubules i bhfréamhacha fiáine Arabidopsis Col a fhástar ar phlátaí MS le nó gan 25 μM KAND 11 a léirshamhlú trí staining imdhíon-histochemical ag baint úsáide as antasubstaintí bunscoile β-tubulin agus antasubstaintí tánaisteacha comhchuingeacha Alexa Fluor.Barra scála = 10 µm.(c) Struchtúr miotógach na micriteibile sa fhréamhmhíristem.Rinneadh micreictiúbáin a léirshamhlú ag baint úsáide as staining imdhíon-histochemical.Rinneadh struchtúir mhiotacha, lena n-áirítear criosanna própáis, fearsaidí, agus phragmoplastaí, a chomhaireamh ó íomhánna comhfhócasacha.Léiríonn saigheada struchtúir miotóiseacha microtubule.Léiríonn réiltíní difríochtaí suntasacha le cóireáil sham (t test, lch< 0.05).n>9. Barra scála = 50 µm.
Cé go bhfuil an cumas ag Ursa cur isteach ar fheidhm microtubule, meastar go mbeidh a mheicníocht gníomhaíochta difriúil ó ghnáthghníomhairí dí-pholaiméireacha microtubule.Mar shampla, spreagann tiúchan níos airde de ghníomhairí dí-pholaiméireacha microtubule mar disopyramide agus oryzalin leathnú anisotrópach ar chealla eipideirm, ach ní dhéanann KAND 11.Ina theannta sin, mar thoradh ar chomh-chur i bhfeidhm KAND 11 agus disopyramide tháinig freagra fáis fréamhacha comhcheangailte disopyramide-spreagtha agus breathnaíodh cosc ar fhás KAND 11-spreagtha ( Fíor. S4 ).Rinneamar anailís freisin ar fhreagra an tsóiteáin disopyramide hypersensitive 1-1 (phs1-1) go KAND 11. Tá sóchán pointe kinase tubulin neamhchanónach ag phs1-1 agus táirgeann sé fréamhacha níos giorra nuair a dhéileáiltear le disopyramide9,20.phs1-1 síológa mutant fás ar mheán agar ina raibh KAND 11 fréamhacha níos giorra cosúil leo siúd a fhástar ar disopyramid (fig. S5).
Ina theannta sin, thugamar faoi deara struchtúir mhiocróbúl miotóiseacha, mar chriosanna própáis, fearsaidí, agus phragmoplastaí, i bhfréamh-mhíristem na síológa a chóireáiltear le KAND 11. Ag teacht leis na breathnuithe do CDKB2; 1p::CDKB2; 1-GUS, laghdú suntasach ar breathnaíodh líon na microtubules mitotic (Fíor .6c).
Chun cíteatocsaineacht KAND 11 a shainiú ag taifeach focheallach, chuireamar cóireáil ar chealla fionraí tobac BY-2 le KAND 11 agus thugamar faoi deara a bhfreagra.Chuireamar KAND 11 le cealla BY-2 ar dtús ag cur in iúl TagRFP-TUA6, a lipéadaíonn microtubules go fluaraiseacha, chun éifeacht KAND 11 ar mhicritiúibíní cortical a mheas.Rinneadh measúnú ar dhlús microtubule cortical ag baint úsáide as anailís íomhá, a rinne cainníochtú ar an gcéatadán picteilíní cítea-chnámharlaigh i measc picteilíní cíteaplasmacha.Léirigh na torthaí measúnachta, tar éis cóireála le 50 μM nó 100 μM KAND 11 ar feadh 1 uair an chloig, tháinig laghdú suntasach ar an dlús go 0.94 ± 0.74% nó 0.23 ± 0.28%, faoi seach, agus b'ionann dlús na gcealla cóireáilte le DMSO , agus 1.63 ± 1.63 ± 0.28%. % (Fíor 7a).Tá na torthaí seo ag teacht leis an tuairim in Arabidopsis go spreagann cóireáil KAND 11 dí-pholaiméiriú micreatubules cortical (Fíor 6b).Rinneamar scrúdú freisin ar an líne BY-2 le filiméid actin lipéadaithe GFP-ABD tar éis cóireála leis an tiúchan céanna de KAND 11 agus thugamar faoi deara gur chuir cóireáil KAND 11 isteach ar na filiméid actin.Laghdaigh cóireáil le 50 μM nó 100 μM KAND 11 ar feadh 1 h dlús filament actin go suntasach go 1.20 ± 0.62% nó 0.61 ± 0.26%, faoi seach, ach ba é an dlús i gcealla cóireáilte DMSO ná 1.69 ± 0.51 % (F).7b).Tá na torthaí seo i gcodarsnacht le héifeachtaí propyzamide, nach ndéanann difear do fhiliméid actin, agus latrunculin B, depolymerizer actin nach ndéanann difear do mhicreatubules (IR Fíor S6).Ina theannta sin, níor chuir cóireáil le coumamonamide 1, aigéad coumamonamide 6, nó KAND 11 isteach ar mhicreatubules i gcealla HeLa (IR Fíor S7).Mar sin, creidtear go bhfuil meicníocht gníomhaíochta KAND 11 difriúil leis an meicníocht a bhaineann le réabthóirí cítea-chnámharlaigh atá ar eolas.Ina theannta sin, léirigh ár mbreathnóireacht micreascópach ar chealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 go raibh bás cille ag tosú le linn cóireála KAND 11 agus léirigh sé nár tháinig méadú suntasach ar chomhréir na gcealla marbha dhaite gorm Evans tar éis 30 nóiméad de chóireáil KAND 11, ach tar éis 90 nóiméad de chóireáil le 50 μM nó 100 μM KAND, tháinig méadú ar líon na gcealla marbh go 43.7% nó 80.1%, faoi seach (Fíor 7c).Nuair a chuirtear le chéile iad, tugann na sonraí seo le fios gur coscaire cítea-chnámharlaigh atá sainiúil do phlanda é an díorthach aigéad ursolic núíosach KAND 11 le meicníocht gníomhaíochta nach raibh ar eolas roimhe seo.
Bíonn tionchar ag KAND ar mhicreatubules cortical, filiméid actin, agus inmharthanacht cealla tobac BY-2.(a) Amharcléiriú ar mhiocr-tiúbúl cortical i gcealla BY-2 i láthair TagRFP-TUA6.Scrúdaíodh cealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 (50 μM nó 100 μM) nó DMSO le micreascópacht chomhfhócasach.Ríomhadh dlús microtubule cortical ó mhicreagraif de 25 cealla neamhspleácha.Léiríonn litreacha difríochtaí suntasacha (tástáil Tukey HSD, lch< 0.05).Barra scála = 10 µm.(b) Filiméid actin cortúla i gcealla BY-2 arna léirshamhlú i láthair GFP-ABD2.Scrúdaíodh cealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 (50 μM nó 100 μM) nó DMSO le micreascópacht chomhfhócasach.Ríomhadh dlús filiméid cortical actin ó mhicreagraif de 25 cealla neamhspleácha.Léiríonn litreacha difríochtaí suntasacha (tástáil Tukey HSD, lch< 0.05).Barra scála = 10 µm.(c) Breathnú ar chealla marbh BY-2 ag Evans staining gorm.Scrúdaíodh cealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 (50 μM nó 100 μM) nó DMSO le micreascópacht réimse geal.n=3.Barra scála = 100 µm.
Tá dul chun cinn suntasach déanta i ngnéithe éagsúla de shaol an duine, lena n-áirítear leigheas agus talmhaíocht, de bharr fionnachtain agus cur i bhfeidhm táirgí nádúrtha nua.Tá taighde stairiúil déanta chun comhdhúile úsáideacha a fháil ó acmhainní nádúrtha.Go háirithe, is eol go bhfuil actinomycetes úsáideach mar antaibheathaigh antiparasíteacha do néimeatóidí mar gheall ar a gcumas meitibilítí tánaisteacha éagsúla a tháirgeadh mar avermectin, comhdhúil luaidhe ivermectin agus bleomycin agus a díorthaigh, a úsáidtear go míochaine mar oibreán frith-ailse21,22.Ar an gcaoi chéanna, thángthas ar chomhdhúile luibhicídeacha éagsúla ó actinomycetes, cuid acu a úsáidtear cheana féin ar bhonn tráchtála1,23.Dá bhrí sin, meastar gur straitéis éifeachtach an anailís ar mheitibilítí actinomycete chun táirgí nádúrtha a leithlisiú le gníomhaíochtaí bitheolaíocha inmhianaithe.Sa staidéar seo, fuaireamar amach comhdhúil nua, coumamonamide, ó S. werraensis agus rinneamar é a shintéisiú go rathúil.Is idirmheánach sintéiseach de urbenamide agus a díorthaigh é aigéad ursonach.D'fhéadfadh sé a bheith ina chúis le tlú fréimhe tréithiúil, gníomhaíocht luibhicídeach measartha go láidir a thaispeáint, agus damáiste a dhéanamh go díreach nó go hindíreach do mhicreatiúbúl plandaí.Mar sin féin, d’fhéadfadh meicníocht ghníomhaíochta aigéid urmotonic a bheith difriúil ó mheicníocht na n-aigéad urmotonic atá ann cheana féin, ós rud é go gcuireann KAND 11 isteach freisin ar fhiliméid actin agus go n-eascraíonn sé bás cille, ag moladh meicníocht rialála trína n-imríonn aigéad urmotonic agus a dhíorthaigh tionchar ar raon leathan struchtúr cítea-chnámharlaigh..
Cabhróidh tréithriú mionsonraithe breise d'aigéad urbenónach le tuiscint níos fearr a fháil ar mheicníocht gníomhaíochta an aigéid urbenónach.Go háirithe, is é an chéad sprioc eile ná measúnú a dhéanamh ar chumas aigéad ursonach chun ceangal a dhéanamh le microtubules laghdaithe chun a chinneadh an ngníomhaíonn aigéad ursonach agus a dhíorthaigh go díreach ar mhicritiúibíní agus iad a dhípholaiméiriú, nó an bhfuil díchobhsú microtubules mar thoradh ar a ngníomh.Ina theannta sin, i gcás nach sprioc díreach iad na microtubules, cabhróidh aithint an tsuímh gníomhaíochta agus spriocanna móilíneacha aigéad ursonaic ar chealla plandaí le tuiscint bhreise a fháil ar airíonna comhdhúile gaolmhara agus ar bhealaí féideartha chun gníomhaíocht luibhicídeach a fheabhsú.Nocht ár measúnú bithghníomhaíochta cumas cíteatocsaineach uathúil an aigéid ursonaigh ar fhás plandaí mar Arabidopsis thaliana, tobac agus lus an ae, cé nach raibh aon tionchar ar na cealla E. coli ná HeLa.Buntáiste a bhaineann le díorthaigh aigéid ursonacha is ea tocsaineacht bheag nó gan tocsaineacht ar bith do chealla ainmhithe má fhorbraítear iad mar luibhicídí le húsáid i bpáirceanna talmhaíochta oscailte.Go deimhin, ós rud é gur struchtúir choiteanna in eocariotáití iad na micritiúibíní, tá a gcosc roghnach i bplandaí ina phríomhriachtanas le haghaidh luibhicídí.Mar shampla, úsáidtear propyzamide, gníomhaire dípholaiméirithe microtubule a cheanglaíonn go díreach le tubulin agus a chuireann cosc ar pholaiméiriú, mar luibhicíd mar gheall ar a thocsaineacht íseal do chealla ainmhithe24.I gcodarsnacht le disopyramide, tá sainiúlachtaí sprice éagsúla ag beinsamídí gaolmhara.Chomh maith le micreictiúibíní plandaí, cuireann RH-4032 nó benzoxamide cosc freisin ar mhicritiúibíní cealla ainmhithe nó oomycetes, faoi seach, agus úsáidtear zalilamide mar fhungaicíd mar gheall ar a fíteatocsaineacht íseal25,26,27.Léiríonn an béar nua-aimsithe agus a díorthaigh cíteatocsaineacht roghnaíoch i gcoinne plandaí, ach is fiú a thabhairt faoi deara go bhféadfadh modhnuithe breise a sainiúlacht sprice a athrú, agus d’fhéadfadh díorthaigh bhreise a sholáthar chun fungais phataigineacha nó oomycetes a rialú.
Tá airíonna uathúla aigéid urbenónach agus a dhíorthaigh úsáideach chun iad a fhorbairt mar luibhicídí agus a úsáid mar uirlisí taighde.Aithnítear go forleathan an tábhacht a bhaineann leis an gcíteascnámharlach maidir le cruth cille plandaí a rialú.Léirigh staidéir níos luaithe go bhfuil meicníochtaí casta eagraíocht microtubule cortical tagtha chun cinn ag plandaí trí dhinimic microtubule a rialú chun morphogenesis a rialú i gceart.Aithníodh líon mór móilíní atá freagrach as gníomhaíocht microtubule a rialáil, agus tá taighde gaolmhar fós ar siúl3,4,28.Ní mhíníonn ár dtuiscint reatha ar dhinimic microtubule i gcealla plandaí meicníochtaí eagraíochta microtubule cortical go hiomlán.Mar shampla, cé gur féidir leis an dá disopyramide agus oryzalin microtubules a dhí-pholaiméiriú, is cúis le disopyramide saobhadh tromchúiseach fréamhacha agus tá éifeacht measartha éadrom ag oryzalin.Ina theannta sin, cuireann sócháin i tubulin, a chobhsaíonn microtubules, faoi deara freisin díxtrorotation i bhfréamhacha, ach ní dhéanann paclitaxel, a chobhsaíonn dinimic microtubules freisin.Dá bhrí sin, ba cheart go soláthródh staidéar agus aithint na spriocanna móilíneacha d'aigéad ursolic léargais nua ar rialáil microtubules cortical plandaí.Ar an gcaoi chéanna, cuirfidh comparáidí amach anseo ar cheimiceáin atá éifeachtach chun fás saobhadh a chur chun cinn, amhail disopyramide, agus ceimiceáin nach bhfuil chomh héifeachtach sin, mar aigéad oryzalin nó kumamotoric, leideanna maidir le conas a tharlaíonn fás saobhadh.
Ar an láimh eile, is féidearthacht eile iad athshocruithe cítea-chnámharlaigh a bhaineann le cosaint chun cíteatocsaineacht aigéid ursonaigh a mhíniú.Uaireanta scriostar an cítea-chnámharlach agus bás cille ina dhiaidh sin mar gheall ar ionfhabhtú paitigin nó tabhairt isteach éilitheoir i gcealla plandaí29.Mar shampla, tuairiscíodh go gcuireann criptoxanthin díorthaithe ó oomycete isteach ar mhicritiúibíní agus filiméid actin roimh bhás cealla tobac, cosúil leis an méid a tharlaíonn le cóireáil KAND30,31.Mar gheall ar na cosúlachtaí idir freagairtí cosanta agus freagairtí ceallacha a tharlódh ó aigéad ursonach, thugamar hipitéis go spreagann siad próisis cheallacha coitianta, cé gur léir go bhfuil éifeacht níos tapúla agus níos láidre ag aigéad ursonach ná mar a bhíonn criptoxanthin.Mar sin féin, tá léirithe ag staidéir go gcuireann cur isteach ar fhiliméid actin bás cille spontáineach chun cinn, rud nach mbíonn cur isteach ar mhicritiúbúl ag gabháil leis i gcónaí29.Ina theannta sin, tá sé fós le feiceáil cé acu an bhfuil an pataigine nó an éilitheoir ina chúis le fás fréamhacha saobhadh, mar a dhéanann díorthaigh aigéad ursonach.Mar sin, is fadhb tharraingteach é eolas móilíneach a nascann freagraí cosanta agus an cíteischnámharlach.Trí leas a bhaint as láithreacht na gcomhdhúile meáchan móilíneach íseal a bhaineann le haigéad ursonach, chomh maith le raon díorthach a bhfuil cumas éagsúil acu, féadfaidh siad deiseanna a sholáthar chun díriú ar mheicníochtaí ceallacha anaithnide.
Le chéile, soláthrófar modhanna cumhachtacha chun aghaidh a thabhairt ar na meicníochtaí casta móilíneacha atá mar bhunús le cinneadh cruth cille plandaí trí fhionnachtain agus cur i bhfeidhm comhdhúile nua a mhodhnóidh dinimic mhicrithubile.Sa chomhthéacs seo, d'fhéadfadh an t-aigéad urmotonic cumaisc a forbraíodh le déanaí, a chuireann isteach ar mhicreatiúibíní agus filiméid actin agus a chothaíonn bás cille, deis a sholáthar chun an nasc idir rialú microtubules agus na meicníochtaí eile seo a dhéanamh amach.Mar sin, cabhróidh anailís cheimiceach agus bhitheolaíoch ag baint úsáide as aigéad urbenónach linn tuiscint a fháil ar na meicníochtaí rialála móilíneacha a rialaíonn an cítea-chnámharlach plandaí.
Ionaclú S. werraensis MK493-CF1 isteach i bhfleascán Erlenmeyer 500 mL baffled ina bhfuil 110 ml de mheán síl comhdhéanta de 2% (w/v) galactós, 2% (w/v) taosrán bun, 1% (w/v) Comhdhéanamh bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) eastóscán arbhar (KOGOSTCH Co., Ltd., an tSeapáin), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 agus 0.2% CaCO3 in uisce dí-ianaithe.(pH 7.4 roimh steiriliú).Goradh na saothráin síl ar chroiteoir rothlach (180 rpm) ag 27°C ar feadh 2 lá.Saothrú táirgeachta trí choipeadh soladstaide.Aistríodh an cultúr síolta (7 ml) isteach i bhfleascán 500 ml K-1 ina bhfuil 40 g de mheán táirgthe comhdhéanta de 15 g de eorna brúite (MUSO Co., Ltd., an tSeapáin) agus 25 g uisce dí-ianaithe (pH gan choigeartú). roimh steiriliú).).Rinneadh coipeadh ag 30°C sa dorchadas ar feadh 14 lá.Baineadh an t-ábhar coipthe le 40 ml/buidéal EtOH agus lártheifneoiríodh é (1500 g, 4°C, 10 min).Baineadh an súiteán cultúir (60 ml) le meascán de 10% MeOH/EtOAc.Galú an ciseal orgánach faoi bhrú laghdaithe chun iarmhar (59.5 mg) a fháil, a cuireadh faoi HPLC le elution grádán (0-10 nóiméad: 90%) ar cholún céim droim ar ais (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × fad 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 nóiméad: 90% H2O/CH3CN go 70% H2O/CH3CN (grádán), 35–45 nóiméad: 90% H2O/EtOH, 45–155 nóiméad: 90% H2O /EtOH go 100% EtOH (grádán (grádán), 155-200 min: 100% EtOH) ag ráta sreafa de 1.5 ml/nóim, scoiteadh coumamonamide (1, 36.0 mg) mar phúdar bán éagruthach.
Kumamotoaimíd(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ luach ríofa: 141.0659, luach tomhaiste: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm
Fuarthas síolta Columbia (Col-0) ó Ionad Acmhainní Bitheolaíochta Arabidopsis (ABRC) le cead úsáide taighde.Rinneadh síolta Col-0 a iomadú agus a chothabháil faoinár gcoinníollacha saotharlainne agus úsáideadh iad mar phlandaí fiáine Arabidopsis.Steiriliú dromchla síolta Arabidopsis agus saothraíodh iad i meán leath-neart Murashige agus Skoog ina raibh 2% de shiúcrós (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) aigéad ethanesulfónach (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) agus 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ag 23 °C agus solas tairiseach.Chuir T. Hashimoto (Institiúid Eolaíochta agus Teicneolaíochta Nara) síolta an tsóiteáin phs1-1 ar fáil.
Chuir T. Hashimoto (Institiúid Eolaíochta agus Teicneolaíochta Nara) síolta brú SR-1 ar fáil agus úsáideadh iad mar phlandaí tobac de chineál fiáin.Rinneadh síolta tobac a steiriliú ar an dromchla agus a sáithiú in uisce steiriúil ar feadh trí oíche chun péacadh a chur chun cinn, ansin iad a chur i dtuaslagán leath-neart ina raibh 2% de shiúcrós, 0.05% (w/v) MES, agus 0.8% guma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.agus meán Skoog) le pH 5.7 agus gortha ag 23°C faoi sholas tairiseach.
Chuir T. Kohchi (Ollscoil Kyoto) Strain Tak-1 ar fáil agus úsáideadh é mar an t-aonad caighdeánach turgnamhach don staidéar ar lus an ae.Fuarthas Gemma ó phlandaí saothraithe aimridithe agus ansin plátáilte ar mheán Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) ina raibh 1% de shiúcrós agus 0.3% guma gealláin agus goraíodh é ag 23°C faoi sholas leanúnach.
Tobac Chuir S. Hasezawa (Ollscoil Tóiceo) cealla BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ar fáil.Caolaíodh cealla BY-2 faoi 95 huaire i meán modhnaithe Linsmeier agus Skoog agus forlíontar iad go seachtainiúil le haigéad 2,4-déchlorophenoxyacetic 32 .Meascadh an fionraí cille ar chroiteoir rothlach ag 130 rpm ag 27 ° C sa dorchadas.Nigh na cealla le 10 n-uaire toirt an mheán úr agus cuir ar fionraí sa mheán céanna.Gintear línte cille trasghéineacha BY-2 a chuireann an marcóir microtubule TagRFP-TUA6 nó an marcóir filiméid actin GFP-ABD2 faoi tionscnóir víreas mósáic cóilis 35S in iúl go cobhsaí mar a thuairiscítear33,34,35.Is féidir na línte cille seo a chothabháil agus a shioncronú trí úsáid a bhaint as nósanna imeachta cosúil leis na cinn a úsáideadh don bhunlíne chill BY-2.
Saothraíodh cealla HeLa i meán modhnaithe Eagle's (DMEM) (Life Technologies) Dulbecco arna fhorlíonadh le séiream bó féatais 10%, peinicillin 1.2 U/ml, agus streiptimícin 1.2 μg/ml i gorlann 37°C le 5% CO2.
Rinneadh na turgnaimh go léir a thuairiscítear sa lámhscríbhinn seo de réir rialacháin agus treoirlínte bithshábháilteachta na Seapáine.
Tuaslagadh comhdhúile i sulfocsaíd démheitil (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) mar réitigh stoic agus caolaíodh iad i meán MS le haghaidh Arabidopsis agus tobac nó meán Gamborg B5 do lus an ae.Maidir leis an measúnacht um chosc ar fhás fréimhe, cuireadh níos mó ná 10 síolta in aghaidh an phláta ar mheán agar ina raibh na comhdhúile sonraithe nó DMSO.Goradh síolta i seomra fáis ar feadh 7 lá.Grianghrafadh na síológa agus rinneadh fad na fréamhacha a thomhas.Maidir le measúnacht ar phéacadh Arabidopsis, cuireadh 48 síolta in aghaidh an phláta ar mheán agar ina raibh 200 μM cumaisc nó DMSO.Fásadh síolta Arabidopsis i seomra fáis agus rinneadh líon na síológa germinated a chomhaireamh 7 lá tar éis phéacadh (dag).Maidir le measúnacht ar phéacadh tobac, cuireadh 24 síolta in aghaidh an phláta ar mheán agar ina raibh 200 μM KAND nó DMSO.Fásadh síolta tobac i seomra fáis agus rinneadh líon na síológa germinated a chomhaireamh tar éis 14 lá.Maidir leis an measúnacht ar chosc ar fhás an t-ae, plátaíodh 9 suthanna ó gach pláta ar mheán agar ina raibh na tiúchain léirithe de KAND nó DMSO agus goraíodh iad i seomra fáis ar feadh 14 lá.
Úsáid síológa daite le 5 mg/ml iaidíd próipidiam (PI) chun eagraíocht an fhréamh-mhiristeam a fheiceáil.Breathnaíodh comharthaí PI trí mhicreascópacht fhluaraiseachta ag baint úsáide as micreascóp scanadh léasair comhfhócasach TCS SPE (Leica Microsystems).
Rinneadh staining histochemical fréamhacha le β-glucuronidase (GUS) de réir an phrótacail a ndearna Malami agus Benfey cur síos air36.Socraíodh síológa in aicéatón 90% thar oíche, daite le 0.5 mg/ml aigéad 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic i maolán GUS ar feadh 1 uair agus cuireadh i dtuaslagán hiodráitithe clóraildéad.(8 g de hiodráit chlórach, 2 ml uisce agus 1 ml gliocról) agus breathnaíodh trí mhicreascóp codarsnachta trasnaíochta difreálach ag baint úsáide as micreascóp Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Rinneadh uillinneacha fréamhacha a thomhas ar síológa 7 lá d'aois a fhástar ar phlátaí a cuireadh go hingearach.Tomhais uillinn na fréimhe ó threo an veicteora domhantarraingthe mar a thuairiscítear i gcéim 6.
Breathnaíodh socrú na micritiúibíní cortical mar a thuairiscítear, le mionathruithe ar an bprótacal 37 .Úsáideadh antashubstaintí frith-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) agus IgG frith-luiche comhchuingeach Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) mar antasubstaintí príomhúla agus tánaisteacha ag 1:1000 agus caoluithe 1:100, faoi seach.Fuarthas íomhánna fluaraiseachta trí úsáid a bhaint as micreascóp scanadh léasair comhfhócasach TCS SPE (Leica Microsystems).Faigh íomhánna Z-stack agus cruthaigh réamh-mheastacháin déine uasta de réir threoracha an mhonaróra.
Rinneadh measúnacht ar iomadú cille HeLa ag baint úsáide as Kit Comhaireamh Cill 8 (Dojindo) de réir threoracha an mhonaróra.
Rinneadh anailís ar fhás E. coli DH5α trí dhlús cille sa chultúr a thomhas ag baint úsáide as speictreafótaiméadar ag 600 nm (OD600).
Breathnaíodh eagrú cítea-chnámharlaigh i gcealla trasgenacha BY-2 ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta atá feistithe le gléas scanadh comhfhócasach CSU-X1 (Yokogawa) agus ceamara sCMOS (Zyla, Andor Technology).Rinneadh measúnú ar dhlús cítea-chnámharlaigh trí anailís íomhá, a rinne cainníochtú ar chéatadán na bpicteilín cítea-chnámharlaigh i measc na bpicteilín cíteaplasma in íomhánna comhfhócasacha ag baint úsáide as bogearraí ImageJ mar a thuairiscítear38,39.
Chun bás cille i gcealla BY-2 a bhrath, goradh slánchuid den fhionraí cille le 0.05% Evans gorm ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra.Braitheann dathú gorm Roghnach Evans ar chealla marbh ar easbhrú an dath ó chealla inmharthana ag an membrane plasma slán40.Breathnaíodh cealla dhaite ag baint úsáide as micreascóp réimse geal (BX53, Olympus).
Fásadh cealla HeLa i DMEM arna fhorlíonadh le 10% FBS i gorlann humidithe ag 37 ° C agus 5% CO2.Cóireáladh cealla le 100 μM KAND 11, aigéad kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), nó 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ar feadh 6 h ag 37°C.Socraíodh cealla le MetOH ar feadh 10 nóiméad agus ansin le haicéatáit ar feadh 5 nóiméad ag teocht an tseomra.Goradh cealla seasta le hantashubstaint β-tubulin bunscoile (1D4A4, Proteintech: 66240-1) caolaithe i 0.5% BSA/PBS ar feadh 2 uair, nite 3 huaire le TBST, agus ansin gortha le Alexa Fluor antashubstaint gabhar.488 1 uair.– Luiche IgG (Thermo Fisher Eolaíoch: A11001) agus 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-feinilindól (DAPI) caolaithe i 0.5% BSA/PBS.Tar éis níocháin le TBST trí huaire, breathnaíodh cealla dhaite ar mhicreascóp inbhéartaithe Nikon Eclipse Ti-E.Gabhadh íomhánna le ceamara Hamamatsu ORCA-R2 CCD fuaraithe ag baint úsáide as bogearraí MetaMorph (Gléasanna Móilíneacha).
Am postála: Jun-17-2024