Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun na torthaí is fearr a fháil, molaimid duit leagan níos nuaí de do bhrabhsálaí a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, táimid ag taispeáint an tsuímh gan stíl ná JavaScript.
Is féidir le fionnachtain agus úsáid thairbheach táirgí nádúrtha cabhrú le saol an duine a fheabhsú. Úsáidtear ceimiceáin choscacha fáis plandaí go forleathan mar luibhicídí chun fiailí a rialú. Mar gheall ar an ngá atá le cineálacha éagsúla luibhicídí a úsáid, tá gá le comhdhúile a bhfuil meicníochtaí gníomhaíochta nua acu a aithint. Sa staidéar seo, thángamar ar chomhdhúil nua N-alcoxapirróil, cúmamonaimíd, ó Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus bhunaíomar an próiseas sintéise iomlán. Trí mheasúnuithe gníomhaíochta bitheolaíocha, thángamar ar an eolas gur idirmheánach sintéiseach de urs-monaimíd é aigéad urs-monaimíd agus go bhfuil acmhainneacht aige...coscaire fáis plandaíIna theannta sin, tá díorthaigh éagsúla aigéad urbeinónach forbartha againn, lena n-áirítear an díorthach urbeinilocsai (UDA), a bhfuil ardghníomhaíocht luibhicídeach aige gan cur isteach go diúltach ar fhás cealla HeLa. Fuaireamar amach freisin go gcuireann díorthaigh aigéad urmotónach isteach ar mhicreatubúil plandaí; ina theannta sin, bíonn tionchar ag KAND ar shnáithíní achtin agus spreagann sé bás cille; Tá na héifeachtaí ilghnéitheacha seo difriúil ó éifeachtaí coscairí micreatubúil aitheanta agus tugann siad le fios meicníocht gníomhaíochta nua d'aigéad ursonach, rud a léiríonn buntáiste tábhachtach i bhforbairt luibhicídí nua.
Is bealach chun feabhas a chur ar cháilíocht na beatha daonna é fionnachtain agus cur i bhfeidhm praiticiúil táirgí nádúrtha tairbhiúla agus a ndíorthaigh. Mar thoradh ar mheitibilítí tánaisteacha a tháirgeann miocrorgánaigh, plandaí agus feithidí, tá dul chun cinn mór déanta sa leigheas agus sa talmhaíocht. Forbraíodh go leor antaibheathach agus drugaí frithleuceimé ó tháirgí nádúrtha. Ina theannta sin, tá cineálacha éagsúla delotnaidicídí, baintear fungaicídí agus luibhicídí as na táirgí nádúrtha seo lena n-úsáid sa talmhaíocht. Go háirithe, is uirlisí tábhachtacha iad luibhicídí rialaithe fiailí chun toradh barr a mhéadú sa talmhaíocht nua-aimseartha, agus úsáidtear cineálacha éagsúla comhdhúile go tráchtála cheana féin. Meastar gur spriocanna tipiciúla luibhicídí iad roinnt próiseas ceallacha i bplandaí, amhail fótaisintéis, meitibileacht aimínaigéad, sintéis bhalla cealla, rialáil mitóise, comharthaíocht fíteahormóin, nó sintéis próitéine. Is aicme choitianta luibhicídí iad comhdhúile a chuireann bac ar fheidhm micreatubúl a théann i bhfeidhm ar fhás plandaí trí thionchar a imirt ar rialáil mitóiseach2.
Is comhpháirteanna den chíteashláintéarach iad micrithiúbail agus tá siad caomhnaithe go forleathan i gcealla eocarótacha. Is éard atá sa heitreadiméir tubúilíneach α-tubúilíneach agus β-tubúilíneach a chruthaíonn prótafhiliméid micrithiúbail líneacha, agus 13 phrótafhiliméad ag cruthú struchtúr sorcóireach. Tá róil iomadúla ag micrithiúbail i gcealla plandaí, lena n-áirítear cruth na cille, deighilt na gceall, agus iompar incheallach a chinneadh3,4. Tá micrithiúbail faoi bhun an scannáin plasma idirchéime i gcealla plandaí, agus meastar go rialaíonn na micrithiúbail chortéiseacha seo eagrú micrishnáithíní ceallalóis trí rialáil coimpléisc shintéise ceallalóis4,5. Tá micrithiúbail chortéiseacha ceallalóis eipideirmeacha fréimhe, atá i láthair sa chrios fadú tapa ar bharr an fhréamh, suite go cliathánach, agus leanann micrishnáithíní ceallalóis na micrithiúbail seo agus cuireann siad teorainn le treo leathnú na gceall, rud a chuireann fadú cille neamh-isotropic chun cinn. Dá bhrí sin, tá feidhm micrithiúbail dlúthbhainteach le moirfeolaíocht plandaí. Is cúis le hionaduithe aimínaigéid i ngéinte a chódaíonn tubulin claonadh i n-eagarraí microtubule cortexacha agus fás ar thaobh na láimhe clé nó na láimhe deise in Arabidopsis 6,7. Ar an gcaoi chéanna, is féidir le sócháin i bpróitéiní a bhaineann le microtubule a rialaíonn dinimic microtubule fás fréimhe saobhtha a bheith mar thoradh orthu freisin8,9,10,11,12,13. Ina theannta sin, is cúis le cóireáil le luibhicídí a chuireann isteach ar microtubule amhail disopyramide, ar a dtugtar pretilachlor freisin, fás fréimhe claonta ar thaobh na láimhe clé14 freisin. Léiríonn na sonraí seo go bhfuil rialáil bheacht ar fheidhm microtubule ríthábhachtach chun treo fáis plandaí a chinneadh.
Tá cineálacha éagsúla coscairí micreatubule aimsithe, agus tá ranníocaíochtaí suntasacha déanta ag na drugaí seo le taighde ar an gcíteashláintíocht, chomh maith le talmhaíocht agus leigheas2. Go háirithe, is féidir le oryzalin, comhdhúile dinitroaniline, disopyramide, comhdhúile gaolmhara le beinsaimíd, agus a n-analógacha feidhm micreatubule a chosc agus dá bhrí sin fás plandaí a chosc. Dá bhrí sin, úsáidtear go forleathan iad mar luibhicídí. Mar sin féin, ós rud é gur cuid thábhachtach de chealla plandaí agus ainmhithe iad micreatubule, tá an chuid is mó de na coscairí micreatubule cíteatocsaineach don dá chineál cealla. Dá bhrí sin, in ainneoin a n-úsáideachta aitheanta mar luibhicídí, úsáidtear líon teoranta gníomhairí frith-mhicreatubule chun críocha praiticiúla.
Is géineas den teaghlach Streptomyces é Streptomyces, lena n-áirítear baictéir aeróbach, gram-dhearfacha, filiméadacha agus atá aitheanta go forleathan as a chumas raon leathan meitibilítí tánaisteacha a tháirgeadh. Dá bhrí sin, meastar gurb é ceann de na foinsí is tábhachtaí de tháirgí nádúrtha nua atá gníomhach ó thaobh na bitheolaíochta de é. Sa staidéar reatha, thángamar ar chomhdhúil nua ar a dtugtar cúmamonaimíd, a leithlisíodh ó Streptomyces werraensis MK493-CF1 agus S. werraensis ISP 5486. Ag baint úsáide as anailís speictreach agus anailís speictreach iomlán, tréithríodh struchtúr cúmamonaimíde agus cinneadh a chnámharlach uathúil N-alcoxapirróil. Fuarthas amach go gcuireann aigéad ursmonach, idirmheánach sintéiseach d'ursmonoamide agus a dhíorthaigh, cosc ar fhás agus ar phéacadh an phlanda mhúnla coitianta Arabidopsis thaliana. I staidéar ar an ngaol idir struchtúr agus gníomhaíocht, fuarthas amach go bhfeabhsaíonn comhdhúil le C9 modhnaithe go haigéad ursonic, ar a dtugtar díorthach nonyloxy d'aigéad ursonic (KAND), an éifeacht chosctha ar fhás agus ar phéacadh go suntasach. Is suntasach gur chuir an coscaire fáis plandaí a aimsíodh le déanaí isteach ar fhás tobac agus lus an ae agus nach raibh sé cíteatocsaineach do bhaictéir ná do chealla HeLa. Thairis sin, spreagann roinnt díorthaigh aigéad úirmótónach feinóip fréimhe saobtha, rud a thugann le fios go mbíonn tionchar díreach nó indíreach ag na díorthaigh seo ar mhicreatubuli. Ag teacht leis an smaoineamh seo, léiríonn ár mbreathnuithe ar mhicreatubuli atá lipéadaithe go himdhíoneolaíoch nó le próitéiní fluaraiseacha go ndípholaiméiríonn cóireáil KAND micreatubuli. Ina theannta sin, cuireann cóireáil le díorthaigh aigéad úirmótónach isteach ar mhicrifhiliméid achtin. Dá bhrí sin, tá coscaire fáis plandaí nua aimsithe againn a bhfuil scriosadh an chíteashchnámharlaigh i gceist lena mheicníocht uathúil gníomhaíochta.
Aonraíodh an strain MK493-CF1 ón ithir i Shinagawa-ku, Tóiceo. Chruthaigh an strain MK493-CF1 mícéiliam strómach dea-bhrainseach. Cinneadh cuid den ghéin RNA ribeasómach 16S (1422 bp). Tá an strain seo an-chosúil le S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipiciúil, 99.93%). Bunaithe ar an toradh seo, cinneadh go raibh dlúthbhaint ag an strain seo leis an strain chineáil de S. werraensis. Dá bhrí sin, thugamar an t-ainm sealadach S. werraensis MK493-CF1 ar an strain seo. Táirgeann S. werraensis ISP 5486T na comhdhúile bithghníomhacha céanna freisin. Ós rud é nach raibh mórán taighde luath déanta ar tháirgí nádúrtha a fháil ón micrea-orgánach seo, rinneadh tuilleadh taighde ceimiceach. Tar éis saothrú S. werraensis MK493-CF1 ar mheán eorna trí choipeadh soladstaide ag 30°C ar feadh 14 lá, rinneadh an meán a bhaint le 50% EtOH. Triomaíodh 60 ml den sampla chun 59.5 mg d'eastóscán amh a fháil. Rinneadh HPLC céim droim ar ais ar an eastóscán amh chun N-meatocsa-1H-pirról-2-carboxaimíd (1, ar a dtugtar cúmamonaimíd, 36.0 mg) a thabhairt. Is ionann méid iomlán 1 agus thart ar 60% den eastóscán amh. Dá bhrí sin, shocraíomar airíonna cúmamotaimíd 1 a staidéar go mion.
Is púdar bán neamhchruthach é cúmamonaimíd 1 agus dearbhaíonn mais-speictriméadracht ardtaifigh (HRESIMS) C6H8N2O2 (Fíor 1). Is sainairíonna don chuid pirróil C2-ionadaithe den chomhdhúil seo δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH i speictream 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) agus δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), agus léiríonn an speictream 13C NMR láithreacht ceithre adamh carbóin sp2. Rinneadh measúnú ar láithreacht grúpa aimíde ag an suíomh C2 trí chomhghaol HMBC ón bprótón C-3 go dtí an carbón carbóinile aimíde ag δC 161.1. Ina theannta sin, léiríonn buaicphointí NMR 1H agus 13C ag δH 4.10 (3H, S) agus δC 68.3 go bhfuil grúpaí N-meatocsa i láthair sa mhóilín. Cé nár cinneadh suíomh ceart an ghrúpa meatocsa go fóill ag baint úsáide as anailís speictreascópach amhail speictreascópacht difríochta feabhsaithe agus giorrúchán Overhauser núicléach (NOEDF), ba é N-meatocsa-1H-pirról-2-carboxamide an chéad chomhdhúil iarrthóra.
Chun struchtúr ceart 1 a chinneadh, rinneadh sintéis iomlán (Fíor 2a). Mar thoradh ar chóireáil 2-aimínpiridín 2 atá ar fáil go tráchtála le m-CPBA, fuarthas an N-ocsaíd 3 comhfhreagrach i dtáirgeacht chainníochtúil. Tar éis 2-aimín-aisídiú 2, rinneadh an t-imoibriú cichlo-chomhdhlúthaithe a thuairiscigh Abramovich i mbeinséin ag 90°C chun an 1-hiodrocsa-1H-pirról-2-charbónítríl 5 atá ag teastáil a fháil i ngraim. Luas 60% (dhá chéim). 15,16. Ansin, thug meitiliú agus hidrealú 4 aigéad 1-meatocsa-1H-pirról-2-charbocsaileach (ar a dtugtar “aigéad cúmótónach”, 6) i dtáirgeacht mhaith (70%, dhá chéim). Ar deireadh, thug aimídiú trí idirmheánach clóiríd aigéid 6 ag baint úsáide as amóinia uiscí aimíd Kumamoto 1 i dtáirgeacht 98%. Bhí na sonraí speictreacha go léir de 1 sintéisithe cosúil le 1 scoite amach, agus mar sin cinneadh struchtúr 1;
Sintéis ghinearálta agus anailís ar ghníomhaíocht bhitheolaíoch urbenamide agus aigéad urbenic. (a) Sintéis iomlán aimíd Kumamoto. (b) Fásadh síológa seacht lá d'aois Arabidopsis Columbia (Col) den chineál fiáin ar phlátaí Murashige agus Skoog (MS) ina raibh cúmamonamide 6 nó cúmamonamide 1 ag na tiúchain a léiríodh. Barra scála = 1 cm.
Ar dtús, rinneamar measúnú ar ghníomhaíochtaí bitheolaíocha urbenamide agus a idirmheánacha maidir lena gcumas fás plandaí a mhodhnú. Chuireamar tiúchain éagsúla d'ursmonamide 1 nó d'aigéad ursmonic 6 le meán agair MS agus shaothraíomar síológa Arabidopsis thaliana ar an meán seo. Léirigh na measúnuithe seo gur chuir tiúchain arda (500 μM) de 6 cosc ar fhás fréimhe (Fíor 2b). Ansin, ghineamar díorthaigh éagsúla tríd an suíomh N1 de 6 a chur in ionad an shuímh agus rinneamar staidéir ar an gcaidreamh struchtúr-ghníomhaíochta orthu (tá cur síos ar an bpróiseas sintéise analógach san Fhaisnéis Tacaíochta (SI)). Fásadh síológa Arabidopsis ar mheán ina raibh 50 μM d'dhíorthaigh aigéad ursonic, agus tomhaiseadh fad na fréimhe. mar a thaispeántar sa phictiúr. Mar a thaispeántar i bhFíor 3a, b, agus S1, tá faid éagsúla de shlabhraí alcocsa líneacha (9, 10, 11, 12, agus 13) nó slabhraí alcocsa móra (15, 16, agus 17) ag aigéid cúmamo ag an suíomh N1. Léirigh na díorthaigh cosc suntasach ar fhás fréimhe. Ina theannta sin, fuarthas amach gur chuir cur i bhfeidhm 200 μM 10, 11, nó 17 cosc ar phéacadh (Fíoracha 3c agus S2).
Staidéar ar an ngaol struchtúr-ghníomhaíochta idir aimíd Kumamoto agus comhdhúile gaolmhara. (a) Scéim struchtúir agus sintéise analógacha. (b) Cainníochtú fad fréimhe síológa 7 lá d'aois a fhástar ar mheán MS le nó gan díorthaigh cúmamonaimíde 50 μM. Léiríonn réaltaí difríochtaí suntasacha le cóireáil bhréige (tástáil t, p< 0.05). n>18. Taispeántar na sonraí mar mheán ± SD. Ciallaíonn nt “gan tástáil” mar níor phéac níos mó ná 50% de na síolta. (c) Cainníochtú ráta péactha síolta cóireáilte a goradh ar feadh 7 lá i meán MS le nó gan 200 μM cúmamonaimíd agus comhdhúile gaolmhara. Léiríonn réaltaí difríochtaí suntasacha le cóireáil bréige (tástáil chi-chearnógach). n=96.
Is suimiúil gur laghdaigh cur leis slabhraí taobh ailcile níos faide ná C9 an ghníomhaíocht choscach, rud a thugann le fios go bhfuil slabhraí taobh de mhéid áirithe ag teastáil ó chomhdhúile gaolmhara le haigéad kumamotoic chun a ngníomhaíocht bhitheolaíoch a léiriú.
Ós rud é gur léirigh anailís ar an ngaol struchtúr-ghníomhaíochta gur modhnaíodh C9 go haigéad úrsónach agus gurbh é díorthach nonilocsai d'aigéad úrsónach (dá ngairtear KAND 11 feasta) an coscaire fáis plandaí ba éifeachtaí, rinneamar tréithriú níos mionsonraithe ar KAND 11. Chuir cóireáil Arabidopsis le 50 μM de KAND 11 cosc beagnach go hiomlán ar phéacadh, ach chuir tiúchain níos ísle (40, 30, 20, nó 10 μM) de KAND 11 cosc ar fhás fréimhe ar bhealach dáileog-spleách (Fíor 4a, b). Chun tástáil a dhéanamh an mbíonn tionchar ag KAND 11 ar inmharthanacht mhíristéime fréimhe, scrúdaíomar míristéimí fréimhe a bhí daite le iaidíd propidiam (PI) agus thomhaiseamar méid achar na míristéime. Ba é 151.1 ± 32.5 μm méid mhíristéime na síológ a fásadh ar mheán ina raibh 25 μM de KAND-11, agus ba é 264.7 ± 30.8 μm méid mhíristéime na síológ a fásadh ar mheán rialaithe ina raibh DMSO (Fíor 4c, d), rud a léiríonn go n-athbhunaíonn KAND-11 gníomhaíocht cheallacha. ag scaipeadh. Míristéim fréimhe. Ag teacht leis seo, laghdaigh cóireáil KAND 11 méid an chomhartha marcóra roinnte cille CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS sa mhíristéim fréimhe (Fíor 4e) 17. Léiríonn na torthaí seo go gcuireann KAND 11 cosc ar fhás fréimhe trí ghníomhaíocht iomadú cille a laghdú.
Anailís ar an éifeacht choscach a bhaineann le díorthaigh aigéid urbeinónaigh (díorthaigh urbeinilocsai) ar fhás. (a) Síológa Col de chineál fiáin 7 lá d'aois a fhásadh ar phlátaí MS leis na tiúchain a léirítear de KAND 11. Barra scála = 1 cm. (b) Cainníochtú fad fréimhe. Léiríonn litreacha difríochtaí suntasacha (tástáil HSD Tukey, lch< 0.05). n>16. Taispeántar na sonraí mar mheán ± SD. (c) Micreascópacht chomhfhócasach fréamhacha Col de chineál fiáin atá daite le iaidíd propidiam a fhástar ar phlátaí MS le nó gan 25 μM KAND 11. Léiríonn lúibíní bána meiristéam fréimhe. Barra scála = 100 µm. (d) Cainníochtú méid meiristéam fréimhe (n = 10 go 11). Cinneadh difríochtaí staitistiúla ag baint úsáide as tástáil-t (p< 0.05). Léiríonn na barraí meánmhéid an mhíristéime. (e) Micreascópacht codarsnachta difreálach (DIC) ar mhíristéim fréimhe ina bhfuil an tógáil CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS daite agus daite ar síológa 5 lá d'aois a fhástar ar phlátaí MS le nó gan anailís KAND 25 µM.
Rinneadh tástáil bhreise ar fhíteatocsaineacht KAND 11 ag baint úsáide as planda déchotailéadónach eile, tobac (Nicotiana tabacum), agus orgánach samhail plandaí talún mór, lus an ae (Marchantia polymorpha). Mar atá i gcás Arabidopsis, tháirg síológa tobac SR-1 a fhásadh ar mheán ina raibh 25 μM KAND 11 fréamhacha níos giorra (Fíor 5a). Ina theannta sin, phéac 40 as 48 síol ar phlátaí ina raibh 200 μM KAND 11, ach phéac na 48 síol go léir ar mheáin chóireáilte bréige, rud a léiríonn go raibh tiúchain níos airde de KAND suntasach (p< 0.05; tástáil chi -cearnóg) chuir cosc ar phéacadh tobac. (Fíor 5b). Ina theannta sin, bhí an tiúchan KAND 11 a chuir cosc ar fhás baictéarach i lus an ae cosúil leis an tiúchan éifeachtach in Arabidopsis (Fíor 5c). Léiríonn na torthaí seo gur féidir le KAND 11 fás plandaí éagsúla a chosc. Ansin rinneamar imscrúdú ar an gcíteatocsaineacht fhéideartha a bhaineann le comhdhúile a bhaineann le monaimíd béir in orgánaigh eile, eadhon cealla HeLa daonna agus strain Escherichia coli DH5α, mar ionadaithe ar chealla ainmhithe agus baictéaracha níos airde, faoi seach. I sraith anailísí iomadú cille, thugamar faoi deara nach raibh tionchar ag cúmamonaimíd 1, aigéad cúmamonaimídeach 6, agus KAND 11 ar fhás cealla HeLa nó E. coli ag tiúchain 100 μM (Fíor 5d,e).
Cosc ar fhás KAND 11 in orgánaigh neamh-Arabidopsis. (a) Fásadh síológa tobac de chineál fiáin SR-1 dhá sheachtain d'aois ar phlátaí MS suite go hingearach ina raibh 25 μM KAND 11. (b) Fásadh síológa tobac de chineál fiáin SR-1 dhá sheachtain d'aois ar phlátaí MS suite go cothrománach ina raibh 200 μM KAND 11. (c) Bachlóga aelusanna Tak-1 de chineál fiáin dhá sheachtain d'aois a fásadh ar phlátaí Gamborg B5 leis na tiúchain a léirítear de KAND 11. Léiríonn saigheada dearga spóir a stop ag fás laistigh den tréimhse goradáin dhá sheachtain. (d) Measúnacht iomadú cille ar chealla HeLa. Tomhaiseadh líon na gcealla inmharthana ag eatraimh ama socraithe ag baint úsáide as trealamh comhaireamh cille 8 (Dojindo). Mar rialú, rinneadh cealla HeLa a chóireáil le 5 μg/ml actinomycin D (Act D), rud a chuireann cosc ar thrascríobh polaiméaráise RNA agus a fhágann bás cille. Rinneadh anailísí faoi thrí. (e) Measúnacht iomadú cille E. coli. Rinneadh anailís ar fhás E. coli trí OD600 a thomhas. Mar rialú, rinneadh cealla a chóireáil le 50 μg/ml ampicillin (Amp), rud a chuireann cosc ar shintéis bhalla cealla baictéarach. Rinneadh trí chóip de na hanailísí.
Chun meicníocht ghníomhaíochta na cíteatocsaineachta de bharr comhdhúile gaolmhara le húraimíd a dhíchódú, rinneamar athanailís ar dhíorthaigh aigéid úrbéinigh a raibh éifeachtaí coisctheacha measartha acu, mar a thaispeántar sa phictiúr. Mar a thaispeántar i bhFíor 2b, 6a, tháirg síológa a fásadh ar phlátaí agair ina raibh tiúchain arda (200 μM) d'aigéad úrmótónach 6 fréamhacha níos giorra agus cuartha ar chlé (θ = – 23.7 ± 6.1), ach i gcás síológa a fásadh ar an meán rialaithe, tháirg na síológa fréamhacha beagnach díreacha (θ = – 3.8 ± 7.1). Is eol go dtagann an fás claonta tréith seo as mífheidhmiú micreatubúl cortex14,18. Ag teacht leis an bhfionnachtain seo, spreag na drugaí díchobhsaithe micreatubúl disopyramide agus oryzalin claonadh fréimhe den chineál céanna faoinár ndálaí fáis (Fíor 2b, 6a). Ag an am céanna, rinneamar tástáil ar dhíorthaigh aigéid úrmótónaigh agus roghnaíomar roinnt acu a spreag fás fréimhe claonta ag tiúchain áirithe. D'athraigh comhdhúile 8, 9, agus 15 treo fáis fréimhe ag 75 μM, 50 μM, agus 40 μM, faoi seach, rud a léiríonn gur féidir leis na comhdhúile seo micreatubaill a dhíchobhsú go héifeachtach (Fíor 2b, 6a). Rinneamar tástáil freisin ar an díorthach aigéad ursólach is cumhachtaí, KAND 11, ag tiúchan níos ísle (15 µM) agus fuarthas amach gur chuir cur i bhfeidhm KAND 11 cosc ar fhás fréimhe agus go raibh treo fáis fréimhe míchothrom, cé gur chlaon siad ar chlé (Fíor C3). . Ós rud é go gcuireann tiúchain níos airde de dhrugaí díchobhsaithe micreatubaill cosc ar fhás plandaí uaireanta seachas claonadh fréimhe a chur faoi deara, rinneamar measúnú ina dhiaidh sin ar an bhféidearthacht go mbíonn tionchar ag KAND 11 ar mhicreatubaill trí mhicreatubaill chortéiseacha a bhreathnú i gcealla eipideirmeacha fréimhe. Léirigh imdhíoneolaíocht ag baint úsáide as antashubstaintí frith-β-tubaill i gcealla eipideirmeacha fréamhacha síolóige a ndearnadh cóireáil orthu le 25 μM KAND 11 imeacht beagnach gach micreatubaill chortéiseach i gcealla eipideirmeacha sa chrios fadaithe (Fíor 6b). Léiríonn na torthaí seo go ngníomhaíonn aigéad cúmamótónach agus a dhíorthaigh go díreach nó go hindíreach ar mhicreatubúil chun iad a chur trína chéile agus gur coscairí nua micreatubúil iad na comhdhúile seo.
Athraíonn aigéad úrsónach agus a dhíorthaigh micreatubaill chortéiseacha in Arabidopsis thaliana. (a) Uillinn chlaonta fréimhe tomhaiste i láthair díorthach éagsúla aigéad úrsónach ag na tiúchain léirithe. Rinneadh anailís freisin ar éifeachtaí dhá chomhdhúil ar a bhfuil a fhios againn go gcuireann siad bac ar mhicreatubaill: dé-phioramíd agus oryzalin. Taispeánann an t-inset an caighdeán a úsáidtear chun uillinn fáis fréimhe a thomhas. Léiríonn réaltaí difríochtaí suntasacha le cóireáil bhréige (tástáil t, p< 0.05). n>19. Barra scála = 1 cm. (b) Micritiúbail chortéiseacha i gcealla eipideirmeacha sa chrios fadaithe. Rinneadh micritiúbail i bhfréamhacha Arabidopsis Col de chineál fiáin a fhásadh ar phlátaí MS le nó gan 25 μM KAND 11 a shamhlú trí dhaiteadh imdhíoneolaíoch ag baint úsáide as antashubstaintí príomhúla β-tiúbailin agus antashubstaintí tánaisteacha Alexa Fluor-chomhchuingithe. Barra scála = 10 µm. (c) Struchtúr miotóiseach na micritiúbail i meiristéim an fhréamh. Rinneadh micritiúbail a shamhlú ag baint úsáide as dhaiteadh imdhíoneolaíoch. Rinneadh struchtúir miotóiseacha, lena n-áirítear criosanna próifáise, fearsaidí, agus fragmaplastaí, a chomhaireamh ó íomhánna comhfhócasacha. Léiríonn saigheada struchtúir micritiúbail miotóiseacha. Léiríonn réaltaí difríochtaí suntasacha le cóireáil bréige (tástáil t, p< 0.05). n>9. Barra scála = 50 µm.
Cé go bhfuil an cumas ag Ursa cur isteach ar fheidhm na micreatubúl, meastar go mbeidh a mheicníocht gníomhaíochta difriúil ó ghníomhairí dípholaiméirithe micreatubúl tipiciúla. Mar shampla, spreagann tiúchain níos airde de ghníomhairí dípholaiméirithe micreatubúl amhail déphoraimid agus oryzalin leathnú ainisotrópach cealla eipideirmeacha, ach ní dhéanann KAND 11 amhlaidh. Ina theannta sin, mar thoradh ar chomhchur i bhfeidhm KAND 11 agus déphoraimide bhí freagairt fhás fréimhe comhcheangailte spreagtha ag déphoraimid agus breathnaíodh cosc fáis spreagtha ag KAND 11 (Fíor S4). Rinneamar anailís freisin ar fhreagairt an mhútaint déphoraimid 1-1 hipiríogaireach (phs1-1) do KAND 11. Tá sóchán pointe cínáis tubulin neamh-chanónach ag phs1-1 agus táirgeann sé fréamhacha níos giorra nuair a dhéantar cóireáil air le déphoraimid9,20. Bhí fréamhacha níos giorra ag síológa mhútaint phs1-1 a fhásadh ar mheán agair ina raibh KAND 11 cosúil leo siúd a fhásadh ar déphoraimid (fíor S5).
Ina theannta sin, bhreathnaíomar struchtúir mhicreatubúl miotóiseacha, amhail criosanna próifáise, fearsaidí, agus fragmaplastaí, i míristéim fréimhe síológa a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11. Ag teacht leis na breathnuithe le haghaidh CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, breathnaíodh laghdú suntasach ar líon na micreatubúl miotóiseach (Fíor .6c).
Chun cíteatocsaineacht KAND 11 ag réiteach focheallach a shainiú, rinneamar cóireáil ar chealla fionraí tobac BY-2 le KAND 11 agus bhreathnaíomar ar a bhfreagairt. Ar dtús, chuireamar KAND 11 le cealla BY-2 a léiríonn TagRFP-TUA6, a lipéadaíonn micreatubaill go fluaraiseach, chun measúnú a dhéanamh ar éifeacht KAND 11 ar mhicreatubaill chortéiseacha. Rinneadh measúnú ar dhlús micreatubaill chortéiseacha ag baint úsáide as anailís íomhá, a chainníochtú céatadán na bpicteilíní cíteashnáithíneach i measc na bpicteilíní cíteashnáithíneach. Léirigh torthaí an anailíse, tar éis cóireála le 50 μM nó 100 μM KAND 11 ar feadh 1 uair an chloig, gur laghdaigh an dlús go suntasach go 0.94 ± 0.74% nó 0.23 ± 0.28%, faoi seach, agus gur shroich dlús na gcealla a ndearnadh cóireáil orthu le DMSO 1.61 ± 0.34% (Fíor 7a). Tá na torthaí seo ag teacht leis an mbreathnóireacht in Arabidopsis go spreagann cóireáil KAND 11 dípholaiméiriú micreatubaill chortéiseacha (Fíor 6b). Rinneamar scrúdú freisin ar an líne BY-2 le filiméid aictin lipéadaithe le GFP-ABD tar éis cóireála leis an tiúchan céanna de KAND 11 agus thugamar faoi deara gur chuir cóireáil KAND 11 isteach ar na filiméid aictin. Laghdaigh cóireáil le 50 μM nó 100 μM KAND 11 ar feadh 1 uair an chloig dlús filiméid aictin go suntasach go 1.20 ± 0.62% nó 0.61 ± 0.26%, faoi seach, ach ba é 1.69 ± 0.51% an dlús i gcealla cóireáilte le DMSO (Fíor 2). 7b). Tá codarsnacht idir na torthaí seo agus éifeachtaí próipiseamíde, nach ndéanann difear do shilitiméid aictin, agus latrunculin B, dípholaiméiritheoir aictin nach ndéanann difear do mhicreatiúbail (Fíor SI S6). Ina theannta sin, ní raibh difear ag cóireáil le cúmamonaimíd 1, aigéad cúmamonaimíde 6, nó KAND 11 do mhicreatiúbail i gcealla HeLa (Fíor SI S7). Dá bhrí sin, creidtear go bhfuil meicníocht ghníomhaíochta KAND 11 difriúil ó mheicníocht ghníomhaíochta na suaiteoirí cíteashláintiúla aitheanta. Ina theannta sin, léirigh ár mbreathnóireacht mhicreascópach ar chealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 go raibh bás cille ag tarlú le linn cóireála KAND 11 agus léirigh sé nár mhéadaigh cion na gcealla marbha daite le gorm Evans go suntasach tar éis 30 nóiméad de chóireáil KAND 11, ach tar éis 90 nóiméad de chóireáil le 50 μM nó 100 μM KAND, mhéadaigh líon na gcealla marbha go 43.7% nó 80.1%, faoi seach (Fíor 7c). Le chéile, léiríonn na sonraí seo gur coscaire cíteashláintiúil plandaí-shonrach é an díorthach aigéad ursólach nua KAND 11 le meicníocht ghníomhaíochta nach raibh a fhios roimhe seo.
Bíonn tionchar ag KAND ar mhicreatubaill chortéiseacha, ar shnáithíní achtin, agus ar inmharthanacht cealla tobac BY-2. (a) Amharcléiriú ar mhicreatubaill chortéiseacha i gcealla BY-2 i láthair TagRFP-TUA6. Rinneadh scrúdú ar chealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 (50 μM nó 100 μM) nó DMSO trí mhicreascópacht chomhfhócasach. Ríomhadh dlús na micreatubaill chortéiseacha ó mhicreagraif de 25 cealla neamhspleácha. Léiríonn litreacha difríochtaí suntasacha (tástáil Tukey HSD, lch.< 0.05). Barra scála = 10 µm. (b) Snáithíní achtin chortéiseacha i gcealla BY-2 léirithe i láthair GFP-ABD2. Rinneadh scrúdú ar chealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 (50 μM nó 100 μM) nó DMSO trí mhicreascópacht chomhfhócasach. Ríomhadh dlús na snáithíní achtin chortéiseacha ó mhicreagraif de 25 chill neamhspleácha. Léiríonn litreacha difríochtaí suntasacha (tástáil Tukey HSD, lch< 0.05). Barra scála = 10 µm. (c) Breathnóireacht ar chealla BY-2 marbha trí dhaiteadh gorm Evans. Rinneadh scrúdú ar chealla BY-2 a ndearnadh cóireáil orthu le KAND 11 (50 μM nó 100 μM) nó DMSO trí mhicreascópacht réimse geal. n=3. Barra scála = 100 µm.
Mar thoradh ar fhionnachtain agus ar chur i bhfeidhm táirgí nádúrtha nua, tá dul chun cinn suntasach déanta i ngnéithe éagsúla den saol daonna, lena n-áirítear leigheas agus talmhaíocht. Rinneadh taighde stairiúil chun comhdhúile úsáideacha a fháil ó acmhainní nádúrtha. Go háirithe, is eol go bhfuil actinomycetes úsáideach mar antaibheathaigh fhrithsheadánacha do néimeatóidí mar gheall ar a gcumas meitibilítí tánaisteacha éagsúla a tháirgeadh amhail avermectin, príomh-chomhdhúil ivermectin agus bleomycin agus a dhíorthaigh, a úsáidtear go míochaine mar ghníomhaire frithailse21,22. Mar an gcéanna, thángthas ar réimse comhdhúile luibhicídeacha ó actinomycetes, agus úsáidtear cuid acu go tráchtála cheana féin1,23. Dá bhrí sin, meastar gur straitéis éifeachtach í anailís a dhéanamh ar mheitibilítí actinomycete chun táirgí nádúrtha a bhfuil gníomhaíochtaí bitheolaíocha inmhianaithe acu a leithlisiú. Sa staidéar seo, thángamar ar chomhdhúil nua, coumamonamide, ó S. werraensis agus shintéiseamar é go rathúil. Is idirmheánach sintéiseach d'urbenamide agus a dhíorthaigh é aigéad ursonic. Is féidir leis lúbadh fréimhe tréith a chur faoi deara, gníomhaíocht luibhicídeach mheasartha go láidir a thaispeáint, agus damáiste díreach nó indíreach a dhéanamh do mhicreatubúil plandaí. Mar sin féin, d'fhéadfadh meicníocht ghníomhaíochta aigéad urmotónach a bheith difriúil ó mheicníocht ghníomhaíochta coscairí micreatubule atá ann cheana féin, ós rud é go gcuireann KAND 11 isteach ar shnáithíní achtin agus go mbíonn bás cille mar thoradh air freisin, rud a thugann le fios meicníocht rialála trína mbíonn tionchar ag aigéad urmotónach agus a dhíorthaigh ar raon leathan struchtúr cíteashláintiúla.
Cabhróidh tréithriú breise mionsonraithe ar aigéad urbeanónach le tuiscint níos fearr a fháil ar mheicníocht ghníomhaíochta aigéid urbeanónaigh. Go háirithe, is é an chéad sprioc eile ná cumas aigéid ursonaigh ceangal le micreatubules laghdaithe a mheas chun a chinneadh an ngníomhaíonn aigéad ursonach agus a dhíorthaigh go díreach ar mhicreatubules agus an ndípholaiméiríonn siad iad, nó an mbíonn díchobhsú micreatubules mar thoradh ar a ngníomhaíocht. Ina theannta sin, i gcás nach sprioc dhíreach iad micreatubules, cabhróidh sainaithint shuíomh gníomhaíochta agus spriocanna móilíneacha aigéid ursonaigh ar chealla plandaí le tuiscint níos fearr a fháil ar airíonna comhdhúile gaolmhara agus ar bhealaí féideartha chun gníomhaíocht luibhicídeach a fheabhsú. Léirigh ár measúnacht bithghníomhaíochta an cumas cíteatocsaineach uathúil atá ag aigéad ursonach ar fhás plandaí amhail Arabidopsis thaliana, tobac agus aelus, agus níor difear do chealla E. coli ná HeLa. Is buntáiste a bhaineann le díorthaigh aigéid ursonaigh beagán nó gan aon tocsaineacht do chealla ainmhithe má fhorbraítear iad mar luibhicídí lena n-úsáid i bpáirceanna talmhaíochta oscailte. Go deimhin, ós rud é gur struchtúir choitianta iad micreatubules in eocarótaí, is riachtanas ríthábhachtach do luibhicídí a gcosc roghnach i bplandaí. Mar shampla, úsáidtear próipisimíd, gníomhaire dípholaiméirithe micreatubúil a cheanglaíonn go díreach le tubulin agus a chuireann cosc ar pholaiméiriú, mar luibhicíd mar gheall ar a thocsaineacht íseal do chealla ainmhithe24. I gcodarsnacht le déphoirimíd, tá sainiúlachtaí sprice difriúla ag beinsaimídí gaolmhara. Chomh maith le micreatubúil plandaí, cuireann RH-4032 nó beinsoxaimíd cosc freisin ar mhicreatubúil cealla ainmhithe nó oomycetes, faoi seach, agus úsáidtear zalilamide mar fhungaicíd mar gheall ar a fhíteatocsaineacht íseal25,26,27. Taispeánann an béar nua-aimsithe agus a dhíorthaigh cíteatocsaineacht roghnach i gcoinne plandaí, ach is fiú a thabhairt faoi deara go bhféadfadh modhnuithe breise a sainiúlacht sprice a athrú, rud a d'fhéadfadh díorthaigh bhreise a sholáthar chun fungais phataigineacha nó oomycetes a rialú.
Tá airíonna uathúla aigéad urbeanónach agus a dhíorthaigh úsáideach dá bhforbairt mar luibhicídí agus dá n-úsáid mar uirlisí taighde. Aithnítear go forleathan tábhacht an chíteashláintéir i rialú cruth cealla plandaí. Léirigh staidéir níos luaithe gur fhorbair plandaí meicníochtaí casta eagrúcháin micreatubúl cortex trí dhinimic micreatubúl a rialú chun moirfeigineas a rialú i gceart. Aithníodh líon mór móilíní atá freagrach as rialáil ghníomhaíocht micreatubúl, agus tá taighde gaolmhar fós ar siúl3,4,28. Ní mhíníonn ár dtuiscint reatha ar dhinimic micreatubúl i gcealla plandaí meicníochtaí eagrúcháin micreatubúl cortex go hiomlán. Mar shampla, cé gur féidir le dé-phioramíd agus oryzalin araon micreatubúil a dhípholaiméiriú, is cúis le dé-phioramíd saobhadh fréimhe tromchúiseach agus bíonn éifeacht sách éadrom ag oryzalin. Thairis sin, is cúis le sócháin i dtubulin, a chobhsaíonn micreatubúil, deasghnáthú i bhfréamhacha freisin, ach ní dhéanann paclitaxel, a chobhsaíonn dinimic micreatubúl freisin. Dá bhrí sin, ba cheart go dtabharfadh staidéar agus sainaithint spriocanna móilíneacha aigéad ursólach léargas nua ar rialáil micreatubúl cortex plandaí. Mar an gcéanna, tabharfaidh comparáidí amach anseo idir ceimiceáin atá éifeachtach chun fás saobhtha a chur chun cinn, amhail déphoraimíd, agus ceimiceáin nach bhfuil chomh héifeachtach, amhail oryzalin nó aigéad kumamotoric, leideanna maidir le conas a tharlaíonn fás saobhtha.
Ar an láimh eile, is féidir athchóirithe cíteashnáithíneacha a bhaineann le cosaint a mhíniú freisin cén fáth a bhfuil aigéad úrsónach ag cur isteach ar an gcíteashnáithín. Uaireanta bíonn scrios ar an gcíteashnáithín agus bás cille ina dhiaidh sin mar thoradh ar ionfhabhtú pataigin nó ar thabhairt isteach elicitor i gcealla plandaí29. Mar shampla, tá tuairiscí ann go gcuireann cripteasanthin díorthaithe ó oomycete isteach ar mhicreatubúil agus ar shnáithíní achtain roimh bhás cille tobac, cosúil leis an méid a tharlaíonn le cóireáil KAND30,31. Mar gheall ar na cosúlachtaí idir freagairtí cosanta agus freagairtí ceallacha a spreagann aigéad úrsónach, táimid tar éis hipitéis a dhéanamh go spreagann siad próisis cheallacha coitianta, cé go bhfuil éifeacht níos tapúla agus níos láidre ag aigéad úrsónach ná cripteasanthin. Mar sin féin, tá sé léirithe ag staidéir go gcuireann cur isteach ar shnáithíní achtain bás cille spontáineach chun cinn, rud nach mbíonn cur isteach ar mhicreatubúil i gcónaí ag gabháil leis29. Ina theannta sin, níl sé soiléir fós an mbíonn fás fréimhe saobhadh mar thoradh ar an pataigin nó ar an elicitor, mar a dhéanann díorthaigh aigéad úrsónach. Dá bhrí sin, is fadhb tharraingteach í an t-eolas móilíneach a nascann freagairtí cosanta agus an cíteashnáithín. Trí leas a bhaint as láithreacht comhdhúile ísealmheáchain mhóilíneacha a bhaineann le haigéad úrsónach, chomh maith le raon díorthach a bhfuil cumhachtaí éagsúla acu, féadfaidh siad deiseanna a sholáthar chun díriú ar mheicníochtaí ceallacha anaithnide.
Le chéile, cuirfidh fionnachtain agus cur i bhfeidhm comhdhúile nua a mhodhnaíonn dinimic micreatubúl modhanna cumhachtacha ar fáil chun aghaidh a thabhairt ar na meicníochtaí móilíneacha casta atá mar bhunús le cinneadh cruth cealla plandaí. Sa chomhthéacs seo, d’fhéadfadh an comhdhúil aigéad urbeónach a forbraíodh le déanaí, a théann i bhfeidhm ar mhicreatubúil agus ar shnáithíní achtin agus a spreagann bás cille, deis a thabhairt chun an nasc idir rialú micreatubúl agus na meicníochtaí eile seo a dhíchifriú. Dá bhrí sin, cabhróidh anailís cheimiceach agus bhitheolaíoch ag baint úsáide as aigéad urbeónach linn na meicníochtaí rialála móilíneacha a rialaíonn cíteashchnámharlach an phlanda a thuiscint.
Cuir S. werraensis MK493-CF1 i bhfleascán Erlenmeyer baicteáilte 500 mL ina bhfuil 110 mL de mheán síl ina bhfuil 2% (m/v) galactós, 2% (m/v) greamaigh easnamh, 1% (m/v) de chomhdhéanamh Bacto. N-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (m/v) eastóscán arbhair (KOGOSTCH Co., Ltd., an tSeapáin), 0.2% (m/v) (NH4)2SO4 agus 0.2% CaCO3 in uisce dí-ianaithe. (pH 7.4 roimh steiriliú). Goradh na cultúir síl ar chroitheadóir rothlach (180 rpm) ag 27°C ar feadh 2 lá. Saothrú táirgthe trí choipeadh stáit sholadaigh. Aistríodh an cultúr síl (7 ml) isteach i bhfleascán K-1 500 ml ina raibh 40 g de mheán táirgthe ina raibh 15 g d'eorna brúite (MUSO Co., Ltd., an tSeapáin) agus 25 g d'uisce dí-ianaithe (níor coigeartaíodh a pH roimh steiriliú). Rinneadh an choipeadh ag 30°C sa dorchadas ar feadh 14 lá. Eastóscadh an t-ábhar coipthe le 40 ml/buidéal EtOH agus rinneadh lártheifneoiriú air (1500 g, 4°C, 10 nóiméad). Eastóscadh an forshnáithín cultúir (60 ml) le meascán de 10% MeOH/EtOAc. Galaíodh an ciseal orgánach faoi bhrú laghdaithe chun iarmhar (59.5 mg) a fháil, a ndearnadh HPLC air le helúnú grádáin (0–10 nóiméad: 90%) ar cholún céim droim ar ais (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × fad 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 nóiméad: 90% H2O/CH3CN go 70% H2O/CH3CN (grádán), 35–45 nóiméad: 90% H2O/EtOH, 45–155 nóiméad: 90% H2O/EtOH go 100% EtOH (grádán (grádán), 155–200 nóiméad: 100% EtOH) ag ráta sreafa 1.5 ml/nóim, aonraíodh cúmamonaimíd (1, 36.0 mg) mar phúdar bán neamhchruthach.
Cúmamótaimíd(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ luach ríofa: 141.0659, luach tomhaiste: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Fuarthas síolta Columbia (Col-0) ó Ionad Acmhainní Bitheolaíocha Arabidopsis (ABRC) le cead úsáide taighde. Rinneadh síolta Col-0 a iomadú agus a chothabháil faoi dhálaí saotharlainne agus úsáideadh iad mar phlandaí Arabidopsis de chineál fiáin. Rinneadh steiriliú dromchla ar shíolta Arabidopsis agus saothraíodh iad i meán leath-neart Murashige agus Skoog ina raibh 2% siúcrós (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (m/v) aigéad 2-(4-morpholino)ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) agus 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ag 23 °C agus solas tairiseach. Soláthraíodh síolta an mhúitant phs1-1 ag T. Hashimoto (Institiúid Eolaíochta agus Teicneolaíochta Nara).
Soláthraíodh síolta den chineál SR-1 ag T. Hashimoto (Institiúid Eolaíochta agus Teicneolaíochta Nara) agus úsáideadh iad mar phlandaí tobac de chineál fiáin. Rinneadh steiriliú dromchla ar shíolta tobac agus sáithíodh iad in uisce steiriúil ar feadh trí oíche chun péacadh a chur chun cinn, ansin cuireadh iad i dtuaslagán leath-neart ina raibh 2% siúcrós, 0.05% (m/v) MES, agus 0.8% guma geallain (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. agus meán Skoog) le pH 5.7 agus goradh iad ag 23°C faoi sholas tairiseach.
Soláthraíodh an strain Tak-1 ag T. Kohchi (Ollscoil Kyoto) agus úsáideadh é mar an t-aonad turgnamhach caighdeánach don staidéar ar an aelus. Fuarthas Gemma ó phlandaí saothraithe steiriliú agus ansin cuireadh ar mheán Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) é ina raibh 1% siúcrós agus 0.3% guma geallain agus goradh é ag 23°C faoi sholas leanúnach.
Soláthraíodh cealla tobac BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) ag S. Hasezawa (Ollscoil Tóiceo). Caolaíodh cealla BY-2 95 oiread i meán modhnaithe Linsmeier agus Skoog agus cuireadh aigéad 2,4-déchlóraifeineacsaiceatach 32 leo gach seachtain. Meascadh an fhionraí cille ar chroitheadóir rothlach ag 130 rpm ag 27°C sa dorchadas. Nigh na cealla le 10 n-uaire an toirt de mheán úr agus athfhionraí iad sa mheán céanna. Gineadh línte cille trasghéineacha BY-2 a léiríonn go cobhsaí an marcóir micreatubule TagRFP-TUA6 nó an marcóir filiméid achtin GFP-ABD2 faoin bpromotóir víreas mósáic cóilis 35S mar a thuairiscítear 33,34,35. Is féidir na línte cille seo a chothabháil agus a shioncrónú ag baint úsáide as nósanna imeachta cosúil leo siúd a úsáideadh don líne cille BY-2 bhunaidh.
Rinneadh cealla HeLa a shaothrú i meán modhnaithe Dulbecco's Eagle (DMEM) (Life Technologies) inar cuireadh 10% séiream féatais bólachta, 1.2 U/ml peinicillin, agus 1.2 μg/ml streiptimícin leis i ngorlann 37°C le 5% CO2.
Rinneadh na turgnaimh uile a thuairiscítear sa lámhscríbhinn seo i gcomhréir le rialacháin agus treoirlínte bithshábháilteachta na Seapáine.
Tuaslagadh na comhdhúile i sulfocsaíd démheitil (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) mar thuaslagáin stoic agus caolaíodh iad i meán MS le haghaidh Arabidopsis agus tobac nó meán Gamborg B5 le haghaidh lus an ae. Chun an anailís chosc fáis fréimhe a dhéanamh, cuireadh níos mó ná 10 síol in aghaidh an phláta ar mheán agair ina raibh na comhdhúile léirithe nó DMSO. Goradh na síolta i seomra fáis ar feadh 7 lá. Tógadh grianghraif de na síológa agus tomhaiseadh fad na bhfréamhacha. Chun an anailís phéactha Arabidopsis a dhéanamh, cuireadh 48 síol in aghaidh an phláta ar mheán agair ina raibh 200 μM de chomhdhúil nó DMSO. Fásadh síolta Arabidopsis i seomra fáis agus comhaireadh líon na síológ péactha 7 lá tar éis péactha (dag). Chun an anailís phéactha tobac a dhéanamh, cuireadh 24 síol in aghaidh an phláta ar mheán agair ina raibh 200 μM KAND nó DMSO. Fásadh síolta tobac i seomra fáis agus comhaireadh líon na síológ péactha tar éis 14 lá. Chun an anailís chosc fáis ar lus an ae, cuireadh 9 suth ó gach pláta ar mheán agair ina raibh na tiúchain a léirítear de KAND nó DMSO agus goradh iad i seomra fáis ar feadh 14 lá.
Bain úsáid as síológa atá daite le iaidíd propidium (PI) 5 mg/ml chun eagrú míristéime fréimhe a léirshamhlú. Breathnaíodh comharthaí PI trí mhicreascópacht fhluaraiseachta ag baint úsáide as micreascóp scanadh léasair chomhfhócasach TCS SPE (Leica Microsystems).
Rinneadh ruaimniú histeiceimiceach fréamhacha le β-glúcúrónídas (GUS) de réir an phrótacail a thuairiscigh Malami agus Benfey36. Socraíodh síológa in aicéatón 90% thar oíche, ruaimníodh iad le 0.5 mg/ml d'aigéad 5-bróma-4-clóra-3-indóilil-β-d-glúcúrónach i maolán GUS ar feadh 1 uair an chloig agus cuireadh iad i dtuaslagán clóraildehíd hiodráitithe (8 g de hiodráit clórail, 2 ml d'uisce agus 1 ml de ghliocról) agus breathnaíodh iad trí mhicreascópacht codarsnachta trasnaíochta difreálach ag baint úsáide as micreascóp Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Tomhaiseadh uillinneacha fréimhe ar síológa 7 lá d'aois a fhásadh ar phlátaí atá suite go hingearach. Tomhais uillinn na fréimhe ó threo an veicteora domhantarraingthe mar a thuairiscítear i gcéim 6.
Breathnaíodh socrú na micreatubúl cortex mar a thuairiscítear, le mionathruithe ar an bprótacal 37. Baineadh úsáid as antashubstaint frith-β-tubuilin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) agus IgG frith-luch comhchuingithe Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) mar antashubstaintí príomhúla agus tánaisteacha ag caoluithe 1:1000 agus 1:100, faoi seach. Fuarthas íomhánna fluaraiseachta ag baint úsáide as micreascóp scanadh léasair comhfhócasach TCS SPE (Leica Microsystems). Faigh íomhánna Z-stack agus cruthaigh teilgin uas-déine de réir threoracha an mhonaróra.
Rinneadh measúnacht iomadú cealla HeLa ag baint úsáide as Cell Counting Kit 8 (Dojindo) de réir threoracha an mhonaróra.
Rinneadh anailís ar fhás E. coli DH5α trí dhlús na gceall i gcultúr a thomhas ag baint úsáide as speictreafótaiméadar ag 600 nm (OD600).
Breathnaíodh eagrú cíteashnáithíneach i gcealla trasghéineacha BY-2 ag baint úsáide as micreascóp fluaraiseachta a raibh gléas scanadh comhfhócasach CSU-X1 (Yokogawa) agus ceamara sCMOS (Zyla, Andor Technology) feistithe air. Rinneadh measúnú ar dhlús cíteashnáithíneach trí anailís íomhá, a chainníochtaigh céatadán na bpicteilíní cíteashnáithíneach i measc na bpicteilíní cíteashnáithíneach in íomhánna comhfhócasacha ag baint úsáide as bogearraí ImageJ mar a thuairiscítear38,39.
Chun bás cille a bhrath i gcealla BY-2, rinneadh cuid den fhionraí cille a ghoradh le 0.05% gorm Evans ar feadh 10 nóiméad ag teocht an tseomra. Braitheann ruaimniú roghnach gorm Evans ar chealla marbha ar easbhrú an ruaime ó chealla inmharthana ag an membrane plasma slán40. Breathnaíodh cealla ruaimnithe ag baint úsáide as micreascóp réimse geal (BX53, Olympus).
Fásadh cealla HeLa i DMEM a raibh 10% FBS curtha leis i ngorlann taisithe ag 37°C agus 5% CO2. Rinneadh na cealla a chóireáil le 100 μM KAND 11, aigéad cúmamonamach 6, cúmamonaimíd 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), nó 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) ar feadh 6 uair an chloig ag 37°C. Socraíodh na cealla le MetOH ar feadh 10 nóiméad agus ansin le haicéatáit ar feadh 5 nóiméad ag teocht an tseomra. Goradh na cealla socraithe le hantashubstaint phríomhúil β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) caolaithe i 0.5% BSA/PBS ar feadh 2 uair an chloig, nite 3 huaire le TBST, agus ansin goradh iad le hantashubstaint gabhair Alexa Fluor. 488 1 uair an chloig. – IgG luiche (Thermo Fisher Scientific: A11001) agus 15 ng/ml 4′,6-dé-aimídín-2-feinilindól (DAPI) caolaithe i 0.5% BSA/PBS. Tar éis níochán le TBST trí huaire, breathnaíodh cealla daite ar mhicreascóp inbhéartaithe Nikon Eclipse Ti-E. Gabhadh íomhánna le ceamara CCD fuaraithe Hamamatsu ORCA-R2 ag baint úsáide as bogearraí MetaMorph (Molecular Devices).
Am an phoist: 17 Meitheamh 2024